2.2.8.1 Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính của enzyme
Sơ đồ 2.7: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của pH lên hoạt tính của enzyme
Enzyme sau khi tinh sạch được sử dụng để nghiên cứu ảnh hưởng của pH lên hoạt tính fucoidanase.
Một hỗn hợp gồm 50 µl enzyme với 200 µl fucoidan (2mg/ml) được pha trong đệm phosphate 0,02M pH từ 3 – 8. Ủ hỗn hợp ở 37oC trong 24 giờ. Xác định hoạt tính enzyme theo phương pháp Nelson-Somogyi [29].
4
3.5 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5
Xác định hoạt tính enzyme theo phương pháp Nelson-Somogyi
Chọn pH cho enzyme hoạt động tối ưu
8
2.2.8.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính enzyme
Sơ đồ 2.8: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt tính enzyme
Một hỗn hợp gồm 50 µl enzyme với 200 µl fucoidan (2mg/ml) được pha trong đệm phosphate 0,02M pH tối ưu. Ủ hỗn hợp ở 25 – 50oC trong 24 giờ. Xác định hoạt tính enzyme theo phương pháp Nelson-Somogyi [29].
2.3. Phương pháp xử lý số liệu
Xử lý số liệu nghiên cứu theo phương pháp thống kê sinh học. Mỗi thí
nghiệm đều tiến hành 3 lần, mỗi lần 3 mẫu và kết quả là trung bình cộng của các lần thí nghiệm.
Số liệu được xử lý được vẽ trên phần mềm Ecxel với hệ số tương quan R≥ 0,95. 25oC 30 oC 35 oC 40 oC 45 oC
Khảo sát hoạt tính enzyme ở các nhiệt độ
Xác định hoạt tính enzyme theo phương pháp Nelson
Chọn nhiệt độ cho enzyme hoạt động tối ưu
PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1.Phân lập các chủng vi sinh vật từ bùn thải trong quá trình sản xuất fucoidan
Để tiến hành tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng sinh enzyme cắt mạch polysaccharide, chúng tôi tiến hành phân lập vi sinh vật từ bùn thải thu từ cống thải của pilot sản xuất fucoidan ở Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang.
Bảng 3.1: Kết quả phân lập vi khuẩn từ bùn thải rong Nâu
STT Kí hiệu chủng Đặc điểm khuẩn lạc
1 SW1 Tròn dẹp
2 SW 2 Tròn, lồi, bóng, vàng nhạt
3 SW 3 Dẹp, viền răng cưa, không màu
4 SW 4 Tròn, bóng, nhỏ, vàng
5 SW 5 Tròn, bóng, vàng, màu trắng đục
6 SW 6 Nhỏ li ti, màu trắng
7 SW 7 Vàng
8 SW 8 Dẹp, viền răng cưa
9 SW 9 Tròn, dẹp trắng
10 SW 10 Màu vàng
11 SW 11 Tròn, vàng, bề mặt nhăn nheo
12 SW 12 Tròn, dẹp, vàng
13 SW 13 Dẹp, viền răng cưa, cam
14 SW 14 Trắng sữa, tròn, bóng
15 SW 15 Giống xạ khuẩn
16 SW 16 Dẹp, viền răng cưa
17 SW 17 Trắng sữa, tròn, nhầy, lồi
18 SW 18 Tròn, dẹp, viền răng cưa
19 SW 19 Trắng lồi, bền mặt nhăn nheo
20 SW 20 Tròn, dẹp, bóng 21 SW 21 Trắng sữa, bóng, lồi 22 SW 22 Vàng, dẹp 23 SW 23 Trắng, bề mặt nhăn, dẹp 24 SW 24 Bóng, lồi, vàng 25 SW 25 Vàng 26 SW 26 Vàng 27 SW 27 Không màu 28 SW 28 Cam 29 SW 29 Dẹp, răng cưa 30 SW 30 Dẹp vàng
Chúng tôi đã phân lập được 30 chủng vi khuẩn, mặc dù được phân lập trên môi trường giống nhau nhưng khuẩn lạc có hình dạng khác nhau nên có thể nhận xét sơ bộ đây là các chủng khác nhau. Các chủng vi khuẩn này được sử dụng để sàng lọc khả năng sinh enzyme bẻ ngắn mạch polysaccharite rong Nâu trên cơ chất là fucoidan
3.2. Sàng lọc các chủng vi sinh vật theo định hướng sinh enzyme cắt mạch polysaccharide
Sau khi phân lập được 30 chủng vi khuẩn, chúng tôi tiến hành sàng lọc khả năng sinh enzyme bẻ ngắn mạch mạch polysaccharide rong Nâu trên từng mẫu cơ
chất là fucoidan cụ thể chiết từ các loài rong khác nhau là : S.mcclurei, Padiana sp,
S.polycystum (các loại fucoidan này được sử dụng làm cơ chất để thử hoạt tính
enzyme), polymannuronic acid và laminaran. Các chủng vi khuẩn được cấy sang bình tam giác chứa môi trường lên men trong môi trường lỏng, nuôi cấy lắc ở 150 vòng/phút, ở nhiệt độ 28 – 30oC, trong 24 giờ.
Bảng 3.2: Kết quả sàng lọc vi khuẩn phân lập được có khả năng sinh enzyme bẻ ngắn mạch polysaccharite
Hoạt tính enzyme U/mg protein STT Kí hiệu chủng Fucoidan S. mcclurei Fucoidan Padina sp. Fucoidan S.polycystum F1 PM Laminaran 1 SW1 0 0 0 0 0,210 2 SW 2 0,226 0,198 0 0 0,324 3 SW 3 0 0 0 0 0 4 SW 4 0 0 0 0 0 5 SW 5 0,270 0,156 0 0 0,023 6 SW6 0 0 0 0 0 7 SW7 0 0,555 0 0 0 8 SW8 0 0 0 0 0,043 9 SW9 0,602 0,963 0,342 0 0,123 10 SW10 0,274 0,456 0 0 0,456 11 SW11 0,377 0,589 0 0 0,321 12 SW12 0 0 0 0 0,120 13 SW13 0 0 0 0 0 14 SW14 0,308 1,051 0 0 0,234
15 SW15 0 0 0 0 0 16 SW16 0 0 0 0 0 17 SW17 0 0 0 0 0 18 SW18 0 0 0 0 0 19 SW19 0 0 0 0 0 20 SW20 0 0 0 0 0 21 SW21 1,263 1,418 0,684 0 0,321 22 SW22 0 1,188 0 0 0 23 SW23 0 0 0 0 0 24 SW24 0 0,104 0 0 0 25 SW25 0 0 0 0 0 26 SW26 0 0 0 0 0 27 SW27 0 0 0 0 0 28 SW28 0,248 1,347 0 0 0 29 SW29 0 0 0 0 0 30 SW30 0 0 0 0 0
Nhìn vào bảng 3.2, chúng tôi nhận thấy trong 30 chủng vi khuẩn được sàng lọc thì có 8 chủng vi khuẩn sinh enzyme bẻ ngắn mạch fucoidan của rong
S.mcclurei, 11 chủng vi khuẩn sinh enzyme bẻ ngắn mạch fucoidan của rong Padiana sp. và 2 chủng vi khuẩn sinh enzyme bẻ ngắn mạch fucoidan của rong S.polycystum.
Trong đó, 5 chủng (SW9, SW14, SW21, SW22, SW28) là những chủng sinh enzyme có hoạt tính cao nhất. Enzyme của các chủng vi khuẩn này tác động khác nhau trên 3 loại cơ chất fucoidan vì fucoidan chiết từ 3 loài rong khác nhau sẽ có cấu trúc và thành phần khác nhau.
Không phát hiện chủng vi khuẩn nào sinh enzyme bẻ ngắn mạch polymannuronic acid và có 10 chủng sinh enzyme thuỷ phân laminaran nhưng hoạt tính không cao.
Enzyme của chủng SW21 tác động lên cả 3 cơ chất fucoidan và đều có hoạt tính cao nhất, do đó chủng SW21 được coi là chủng có tiềm năng và được lựa chọn
để thực hiện các nghiên cứu tiếp theo. Cơ chất fucoidan chiết từ rong S.mcclurei là
cơ chất được sử dụng xuyên suốt trong quá trình nghiên cứu tiếp theo vì có hoạt tính và nồng độ fucoidan cao.
3.3. Kết quả nghiên cứu điều kiện tối ưu để chủng SW21 phát triển và sinh enzyme fucoidanase hoạt tính cao. enzyme fucoidanase hoạt tính cao.
3.3.1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ fucoidan
Bảng 3.3: Ảnh hưởng của nồng độ fucoidan lên sự sinh tổng hợp fucoidanase của chủng SW21
Nồng độ fucoidan (%) Hoạt tính fucoidanase (U/mg protien)
0 0,123 0,005 0,359 0,010 2,236 0,015 0,854 0,020 0,574 0,030 0,038
Kết quả cho thấy nồng độ fucoidan thích hợp để chủng này phát triển và sinh tổng hợp fucoidanase là 0,01% (m/v) (Bảng 3.3). Nếu tiếp tục tăng nồng độ cơ chất cảm ứng thì hoạt tính enzym thu được giảm vì khi đó xảy ra hiện tượng ức chế. Do fucoidan có cấu tạo mạch polymer làm cho độ nhớt môi trường tăng lên và gây ảnh hưởng đến bề mặt trao đổi chất của vi sinh vật dẫn đến quá trình sinh tổng hợp giảm.
3.3.2. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ Nitơ
Bảng 3.4: Ảnh hưởng của nguồn nitơ lên sự phát triển và sinh tổng hợp fucoidanase của chủng SW21
Nguồn nitơ OD 660nm Hoạt tính fucoidanase
(U/mg protein) NH4NO3 0,382 0 KNO3 0,375 0 (NH4)2SO4 0,420 0 Dịch chiết nấm men 2,504 0,417 Bacto Pepton 2,428 1,792 Pepton thịt 2,303 1,176
Bacto pepton + dịch chiết
nấm men (5:1) 2,893 3,076
Kết quả cho thấy nguồn nitơ vô cơ không thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của chủng SW21. Dịch chiết nấm men, Bacto pepton và pepton thịt đều thích hợp cho sự phát triển của vi khuẩn. Tuy nhiên hoạt tính fucoidanase thu được tốt nhất khi chủng vi khuẩn này được nuôi trên môi trường chứa Bacto pepton và dịch chiết nấm 5:1 (Bảng 3.4)
3.3.3. Khảo sát ảnh hưởng của pH
pH môi trường ảnh hưởng mạnh mẽ đến sinh trưởng, tác động sâu sắc đến các quá trình trao đổi chất của vi sinh vật. Những biến đổi dù nhỏ của các ion (H+ và OH-) trong nồng độ của chúng cũng ảnh hưởng mạnh mẽ đến vi sinh vật. Bên cạnh đó, hoạt tính enzyme cũng phụ thuộc vào pH của môi trường.Vì vậy, trong thời gian nuôi cấy vi sinh vật sinh enzyme, việc xác định pH ban đầu và duy trì là cần thiết.
Hình 3.1: Ảnh hưởng của pH lên sự phát triển và khả năng sinh enzyme fucoidanase của chủng SW21
Dựa trên nguồn nitơ và nồng độ fucoidan tối ưu trên, khảo sát ảnh hưởng của dãi pH từ 6.0 đến 8.0 đến sự sinh tổng hợp enzyme. Kết quả cho thấy chủng SW21 có khả năng sinh tổng hợp enzym cao trên môi trường trung tính. pH thích hợp nhất cho sự phát triển và sinh tổng hợp enzyme fucoidanase của chủng SW21 là 7,0 – 7,5 nên pH này sẽ được chọn cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.3.4. Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ nuôi cấy lắc
Hình 3.2: Ảnh hưởng của tốc độ nuôi cấy lắc lên khả năng sinh enzyme của chủng SW21
Kết quả nghiên cứu cho thấy tốc độ khuấy có ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của chủng SW21. Chủng SW21 phát triển tốt hơn khi được khuấy trộn so với không khuấy bởi vì nhờ khuấy trộn nên các vi khuẩn được tiếp xúc nhiều hơn với chất dinh dưỡng có trong môi trường nuôi cấy. Khuấy trộn còn giúp cho các chất ức chế do chính vi khuẩn này sinh không bám dính vào vi khuẩn để gây ức chế trở lại. Ngoài ra, khuấy trộn cũng có tác dụng tăng hàm lượng oxy hòa tan trong môi trường giúp vi khuẩn phát triển tốt hơn.Tuy nhiên ở tốc độ khuấy trộn cao thì sự phát triển của chủng có phần chậm lại có thể do tốc độ quá cao nên các hoạt động hấp thu dinh dưỡng, chuyển hóa có thể bị ảnh hưởng.
Qua thí nghiệm này, chúng tôi thấy chủng SW21có khả năng sinh tổng hợp enzyme tốt nhất ở tốc độ nuôi cấy lắc là 160 vòng/phút.
3.3.5. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến quá trình sinh trưởng và tổng hợp fucoidanase fucoidanase
Việc xác định thời gian nuôi cấy của mỗi loài vi khuẩn là rất quan trọng. Nó cho biết khả năng thích nghi với môi trường cũng như thời gian của các giai đoạn phát triển của các chủng giúp ta kiểm soát quá trình nuôi cấy. Bên cạnh đó, còn có thể cho biết thời điểm sinh khối tế bào lớn nhất giúp ta dừng quá trình lên men trong thời gian hợp lý để thu sinh khối tế bào.
Hình 3.3: Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến quá trình sinh trưởng và tổng hợp fucoidanase
Quan sát chủng trong quá trình nuôi cấy, chủng SW21 sẽ phát triển qua 4 pha liên tiếp bao gồm: pha lag, pha log, pha cân bằng và pha tử vong.
Ở pha lag (6 giờ đầu của quá trình nuôi cấy), pha lag được tính từ lúc bắt đầu cấy giống đến khi vi khuẩn đạt được tốc độ sinh trưởng cực đại. Trong pha lag vi khuẩn chưa phân chia, nhưng trọng lượng và thể tích tế bào tăng rõ rệt do trong thời
kì này vi khuẩn đang làm quen với môi trường và chất dinh dưỡng. Kết quả (Hình 3.3) cho thấy, pha lag diễn ra trong vài giờ đầu nuôi cấy.
Đến pha log (từ 6 giờ đến 18 giờ nuôi), nồng độ tế bào tăng nhanh chóng vì sau pha lag trong môi trường nuôi đã có số lượng lớn các tế bào đã thích nghi. Bên cạnh đó, đây cũng là thời gian vi sinh vật có khả năng tổng hợp các enzyme ngoại bào lớn nhất để phân giải các chất dinh dưỡng trong môi trường. Vì vậy, giai đoạn này các tế bào vi sinh vật diễn ra quá trình trao đổi chất diễn mạnh mẽ nhất, dẫn đến số lượng tế bào tăng theo lũy thừa. Kết quả cho thấy sau 6h nuôi, giá trị OD đo được của chủng SW21 là 1,61 (đạt 70 % so với giá tri OD cực đại. Ở pha này OD660 tăng liên tục, cứ sau 6h nuôi cấy thì giá trị OD660 tăng khoảng 12 ÷ 14% (so với giá trị cực đại) cho đến khi các chủng phát triển chậm lại sau 18h nuôi cấy. Ở cuối pha này, mặc dù số lượng tế bào chưa đạt lớn nhất nhưng quần thể tế bào có trạng thái sinh hóa, sinh lý cơ bản là như nhau và tế bào vi sinh vật đã hoàn thiện nhất cho nên việc nuôi cấy ở giai đoạn này thường được sử dụng để nghiên cứu sinh hóa và sinh lý của vi sinh vật.
Bước sang pha cân bằng (từ 18 giờ đến 36 giờ nuôi) thì tốc độ sinh trưởng cũng như khả năng trao đổi chất giảm. Số lượng tế bào chết cân bằng với số tế bào sinh ra. Một số nguyên nhân khiến vi khuẩn chuyển sang pha cân bằng như: chất dinh dưỡng cạn kiệt, nồng độ oxi giảm, các chất độc tích lũy, pH giảm. Mặc dù ở giai đoạn này tốc độ tăng trưởng của tế bào vi sinh vật chậm lại nhưng đây lại là giai đoạn số lượng tế bào vi sinh vật là lớn nhất nên thường chọn thời điểm trong giai đoạn cân bằng để thu sinh khối vi sinh vật. Kết quả OD660 nm đo được cũng thể hiện rõ giá trị OD660 nm ở pha cân bằng lớn hơn so với ở các pha khác và sau 24h nuôi chủng SW21 có nồng độ tế bào cao nhất.
Pha suy vong ( sau 36 giờ) thì nồng độ tế bào cả hai chủng bắt đầu giảm xuống. Đến khoảng 42h nuôi thì mật độ tế bào của chủng giảm nhanh, nồng độ tế bào của chủng SW21 chỉ còn đạt được 87% (so với giá trị cực đại). Điều này cho thấy vi sinh vật đã đến giai đoạn suy vong do chất dinh dưỡng trong môi trường giảm xuống, sản phẩm bài tiết quá nhiều, vi khuẩn chết đi và tự phân nhờ các
enzyme của bản thân.. Vì vậy trong quá trình nuôi cấy tránh để vi sinh vật đạt đến giai đoạn này.
Từ kết quả thí nghiệm ta thấy khả năng sinh trưởng và hoạt tính enzyme của chủng SW21 tăng mạnh sau 6 giờ nuôi cấy,bắt đầu pha ổn định sau 18 giờ nuôi cấy và đạt giá trị cực đại sau 24 giờ nuôi cấy lắc (Hình 3.3). Hoạt độ fucoidanase thu
được giảm đi nhanh chóng khi bắt đầu pha suy vong, sau 36 giờ nuôi cấy
3.4. Kết quả nghiên cứu điều kiện xúc tác của enzyme.
3.4.1. Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính của enzyme
Hình 3.4: pH tối ưu của fucoidanase chiết từ chủng SW21
Kết quả nghiên cứu cho thấy pH thích hợp cho hoạt động của fucoidanase từ chủng SW 21 trong khoảng 6.0-7.5 (Hình 3. 4). Trong đó enzym hoạt động tối ưu ở pH 6,5.
Kết quả này chúng tôi nhận khác với một số loài vi sinh vật khác như vi sinh
vật biển Vibrio sp. N-5 có pH hoạt động tối ưu là 7,5 [19], trong khi đó một số vi
pH tối ưu cho hoạt động của enzym Fucoidanase của chủng SW21 cũng khác với
Fucoidanase của động vật thân mềm Haliotis sp. là 5,4 [39] và Littorina kurila là
5,6 [23].
3.4.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính enzyme
Hình 3.5: Nhiệt độ tối ưu để enzyme fucoidanase từ chủng SW21 hoạt động
Kết quả (Hình3.5) cho thấy fucoidanase hoạt động tốt nhất ở 35oC. Từ 50oC trở đi enzym bắt đầu bị biến tính nên hoạt tính giảm đi nhanh chóng.
Kết quả chúng tôi nhận được tương tự so với một số công trình của các nhà khoa học Nhật Bản khi nghiên cứu các enzym fucodanase từ một số loài sinh vật biển, trong khi một số vi sinh vật biển khác lại có enzym hoạt động ở nhiệt độ tối ưu là 30 - 35oC [37].
Nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của enzym fucoidanase của chủng SW21 có
PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận
Sau quá trình phân lập và sàng lọc khả năng sinh enzyme phân cắt
polysaccharide từ bùn thải trong quá trình sản xuất của nhà máy sản xuất fucoidan, chúng tôi đã thu được một số kết quả sau:
1. Chúng tôi đã phân lập được 30 chủng vi khuẩn từ bùn thải trong quá trình sản xuất fucoidan của nhà máy sản xuất Fucoidan. Trong đó, 5 chủng (SW9, SW14, SW21, SW22, SW28) có khả năng năng sinh enzyme bẻ ngắn mạch fucoidan trên 3 loại cơ chất fucoidan được chiết từ 3 loài rong Nâu
S.mcclurei, S.polycystum, và Padina sp. với hoạt tính cao. Chủng SW21 là
chủng vi khuẩn có hoạt tính enzyme cao nhất trên cả 3 loại fucoidan. Enzyme có hoạt tính bẻ ngắn mạch fucoidan đều là enzyme nội bào.