- Cân 10g mẫu cho vào bình tam giác chứa 90ml nước cất vô trùng, lắc đều rồi tiến hành pha loãng ở các nồng độ khác nhau.
- Chuẩn bị các ống nghiệm, mỗi ống chứa 9ml dung dịch nước muối sinh lý đã được hấp khử trùng.
- Hút 1ml ở bình tam giác sau khi lắc đều vào ống nghiệm, thu được dịch mẫu pha loãng với nồng độ 10-1, rồi đưa lên máy vortex để trộn đều.
- Từ ống nghiệm 10-1, pha loãng ra ống nghiệm có nồng độ thấp hơn 10-2 bằng cách hút 1ml từ ống nghiệm 10-1 cho vào 9ml dung dịch nước muối sinh lý đã hấp khử trùng ở ống nghiệm khác, rồi đưa lên máy vortex để trộn đều, thu được ống nghiệm có độ pha loãng mẫu 10-2, cứ làm như vậy cho đến khi được nồng độ thí nghiệm (để có số khuẩn lạc trên đĩa phù hợp, mẫu thường được pha loãng. Do hiếm khi biết trước được nồng độ vi sinh vật trong mẫu, người ta dùng nhiều nồng độ khác nhau). Tùy vào số lượng vi sinh vật nhiều hay ít mà ta cho nồng độ cấy thích hợp (thường từ 10-3 – 10-8).
- Môi trường phân lập vi sinh vật được chuẩn bị, hấp khử trùng và phân phối vào các đĩa petri, mỗi đĩa 10 – 15ml. Dùng pipet man hút 0,1 ml dịch đã pha loãng nhỏ vào đĩa thạch đã ghi tên mẫu, nồng độ và ngày phân lập. Dùng que cấy tran trang đều dịch mẫu trên bề mặt thạch. Sau 3 – 7 ngày ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ 30oC, vi khuẩn đã phát triển trên đĩa thạch, ta tiến hành hành quan sát, tách và thuần khiết khuẩn lạc.
- Tách và thuần khiết khuẩn lạc: Chọn những khuẩn lạc riêng rẽ trên đĩa petri cấy rồi cấy vào ống nghiệm, mỗi khuẩn lạc cấy vào một ống (ghi kí hiệu đầy đủ để cho các bước nghiên cứu tiếp theo), đặt vào tủ ẩm 30oC. Sau các khoảng thời gian thích hợp cấy ziczac ra đĩa petri để tinh sạch các chủng vi sinh vật, tiến hành tinh sạch nhiều lần. Kiểm tra độ thuần khiết của giống bằng cách kiểm tra vết cấy, kiểm tra
độ thuần chủng của các khuẩn lạc và kiểm tra tế bào dưới kính hiển vi. Khi được khuẩn lạc thuần nhất và tách rời trên đĩa thạch thì cấy vào ống nghiệm giữ giống. - Phương pháp giữ giống và cấy chuyền: Sau khi tinh sạch xong ta chọn khuẩn lạc mọc riêng rẽ cấy vào ống nghiệm thạch nghiêng. Tiến hành cấy ziczac trên ống thạch nghiêng để được giống thuần khiết. Giống thuần khiết được bảo quản trong tủ lạnh ở 4oC, thời gian tốt nhất là 1 tháng. Sau 1 tháng tiến hành cấy chuyền định kì để đảm bảo dinh dưỡng cho vi sinh vật. Trước khi sử dụng chủng thuần khiết cần được hoạt hóa.