- Nhóm tác giả Đào Mỹ Thanh-Nguyễn Sĩ Hào (2005) ñiều tra tại thành phố Hồ Chí Minh cho thấy: có 70% người sản xuất, kinh doanh và 69% người tiêu dùng có biết hàn the là chất phụ gia cấm sử dụng; có 91,3% người sản xuất - kinh doanh và 9,5% người sử dụng không biết hàn the là chất ñộc; 22% người sản xuất- kinh doanh và; có 68% người tiêu dùng chấp nhận mua bán, sử dụng thực phẩm có chứa hàn the [36].
- Nhóm tác giả Đỗ Thị Hòa, Ngô Thị Kim Dung và Trần Xuân Bách (nguồn: Tạp Chí Y học thực hành, số 10/2007): Tại các chợ của phường Đông Ba, tỉ lệ có hàn the trong thực phẩm chế biến từ thịt là 39,6%; giò lụa (46,6%), chả quế (44%), chả mộc (27,8%); Tại chợ của quận Hai Bà Trưng: giò lụa và chả quế (25%), giò bò và chả mỡ (21,4%), thực phẩm chế biến từ gạo, có từ 10-20%.
- Tại Đăk Lắk, Tạ Đức Thịnh và cộng tác viên trường Đại học Tây Nguyên (Kỷ yếu hội nghị khoa học tuổi trẻ các trường Đại học và Cao ñẳng khối Nông – Lâm – Ngư toàn quốc lần thứ 4, Thái Nguyên, 3/2009): tồn dư Borax trong thịt và một số sản phẩm thịt ở một số chợ tại thành phố Buôn Ma Thuột – Đắk Lắk, với tỉ lệ mẫu có tồn dư Borax là 14,28% (6-7 giờ), 71,42% (14-16 giờ), trung bình trong ngày là 42,95% [37].
1.8. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH TỒN DƯ KHÁNG SINH VÀ BORAX TRONG THỊT BORAX TRONG THỊT
1.8.1. Các phương pháp phân tích tồn dư KS trong thịt
Hiện nay có nhiều phương pháp ñể kiểm tra ñịnh tính và ñịnh lượng KS trong thịt tươi. Mỗi phương pháp có những ưu và nhượt ñiểm khác nhau, tùy thuộc vào từng quốc gia, từng khu vực và các tổ chức mà sử dụng các phương pháp và các tiêu chuẩn khác nhau. Ở Việt Nam, chủ yếu ñang sử dụng các phương pháp sau:
1.8.1.1. Phương pháp sử dụng vi sinh vật: (FPT: Four plate test hay Frontier post test). Qui trình này liên quan ñến việc nuôi cấy các chủng vi khuẩn nhạy cảm trên ñĩa thạch có sự hiện diện của mẫu thịt nghi ngờ tồn dư KS. Nếu mẫu thịt có tồn dư KS thì xung quanh nó sẽ có vòng vô khuẩn do sự khuyếch tán của KS từ mẫu thịt ra môi trường thạch ức chế sự phát triển của vi khuẩn (Heitzman, 1994).
1.8.1.1. Phương pháp miễn dịch enzym (kiểm tra sự có mặt của Sulfornamid): phương pháp này thường gặp phải những khó khăn trong khâu tạo ra các tác nhân sinh miễn dịch (Immunogen) mà không làm hư hỏng cấu trúc phân tử của thuốc.
1.8.1.3. Phương pháp miễn dịch phóng xạ (RIA = Radio Immuno Assay): Trong kỹ thuật này, sự hình thành phức hợp kháng nguyên kháng thể ñược ño lường bằng cách sử dụng kháng nguyên ñánh dấu phóng xạ (ñã biết trước số lượng và kháng nguyên không ñánh dấu phóng xạ (chất cần tìm) cho tiếp xúc với một số lượng ấn ñịnh các kháng thể. Sẽ có sự cạnh tranh gắn kết với các vị trí hoạt ñộng của kháng thể giữa hai kháng nguyên này. Sau một thời gian, một số kháng nguyên gắn kết với kháng thể, một số tự do. Tỉ số gắn kết tương ñối của kháng nguyên ñánh dấu và kháng nguyên không ñánh dấu với kháng thể phụ thuộc vào tỉ số nồng ñộ tương ñối của kháng nguyên ñánh dấu và kháng nguyên không ñánh dấu. Hoạt tính phóng xạ của phức hợp kháng nguyên – kháng thể càng thấp thì nồng ñộ kháng nguyên không ñánh dấu càng cao. Hoạt tính này ñược xác ñịnh bằng máy ñếm phóng xạ trong chất lỏng sau khi ñã tách phức hợp kháng nguyên – kháng thể ra khỏi phần tự do. So sánh với ñường cong chuẩn, người ta sẽ xác ñịnh ñược lượng kháng nguyên cần tìm (FAO, 1990).
1.8.1.4. Phương pháp sắc ký (Chromatography): “sắc ký” có nghĩa là ghi màu, bắt nguồn từ thí nghiệm phân tích chất màu thực vật trên cột chứa một chất hấp phụ của nhà hóa học người Nga (Tsvet, 1903). Nguyên tắc cơ bản của phương
pháp này là: một pha ñộng di chuyển qua một pha tĩnh và kéo các chất tan trong hỗn hợp hợp phân tích di chuyển theo với tốc ñộ khác nhau. Quá trình di chuyển của các chất tan giữa hai pha là quá trình hấp phụ và phản hấp phụ xẩy ra hoặc phân bố và rửa giải ra liên tục. Kết quả là các chất tan trong hỗn hợp ñược tách ra. Nếu căn cứ vào trạng thái của pha ñộng thì ñược gọi là phương pháp sắc ký lỏng và phương pháp sắc ký khí. Nếu dựa vào hình dạng của pha tĩnh thì có: phương pháp sắc ký cột, phương pháp sắc ký lớp mỏng, phương pháp sắc ký giấy (từ ñiển bách khoa dược học, 1999)
1.8.1.5. Phương pháp sắc kí lỏng cao áp (HPLC )
Trong kỹ thuật sắc kí lỏng cao áp (HPLC=High Pressure Liquid Chromatoghraphy), các phân tử hấp thụ (pha tĩnh) ñược nhồi chặt vào trong các ống hình trụ (cột) bằng thủy tinh, chất dẻo và thép không gỉ có ñường kính và chiều dài thay ñổi tùy theo yêu cầu của phân tích. Một pha ñộng ñược ñẩy ñi qua cột pha tĩnh bằng bơm áp lực. Tốc ñộ pha ñộng ñược ñiều chỉnh bằng bơm áp lực. Khi bơm 1 lượng nhỏ chất tan (chất thử) vào máy, ở mỗi ñiểm của cột phân tích sẽ có 1 cân bằng giữa phần chất tan bị lưu giữ trên pha tĩnh và phần chất tan tồn tại trong pha ñộng. Hệ số phân tách K là tỉ số giữa nồng ñộ chất tan trong pha tĩnh và nồng ñộ chất tan trong pha ñộng. Chất tan ñược ñẩy ra khỏi cột sau 1 thời gian dài ngắn phụ thuộc vào hệ số phân tách K ñặc trưng cho hệ chất tan – pha ñộng ñã dùng. Hỗn hợp các chất tan có hệ số K khác nhau sẽ ra khỏi cột sau những thời gian khác nhau, thời gian này ñược gọi là thời gian lưu Rt của mỗi chất tan tương ứng. Như vậy, các chất tan trong hỗn hợp ñã ñược tách riêng rẽ và một ñầu dò (Detector) thích hợp (ví dụ: các chất KS thì dùng ñầu dò UV – VIS...).. ñặt sau cột tách sẽ cho các tín hiệu tương ứng, làm dịch chuyển bút ghi trên máy ghi ñể vẽ các ñỉnh (peak) trên sắc ñồ. Trên cơ sở mối quan hệ tuyến tính giữa diện tích sắc ñồ chuẩn, diện tích sắc ñồ mẫu và nồng ñộ chất chuẩn, ta tính ñược nồng ñộ chất cần phân tích (Nguyễn Đức Trang, 1998). Máy tích phân
nhanh chóng cho kết quả các diện tích thu ñược. Ngày nay, nhờ hệ thống xét nghiệm tự ñộng (Autosamplers) và hệ thống truy cập dữ liệu qua máy ñiện toán, kỹ thuật HPLC ñã trở nên rất hữu dụng cho việc phân tích 1 số lượng lớn các mẫu thử. (FAO, 1993; Từ ñiển bách khoa dược học, 1999) [1], [Tr.21- 41]
1.8.1.6. Phương pháp xác ñịnh dư lượng nhóm Aureomycin bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC)
Nguyên tắc
Trước hết, chất cần phân tích phải ñược chiết ra khỏi dung dịch mẫu bằng hệ dung dịch ñệm phù hợp. Sau ñó bơm dung dịch này vào cột sắc ký HPLC có chứa chất nhồi (pha tĩnh) là nhựa RP-18, khi ñó Aureomycin bị hấp thụ lên pha tĩnh này. Muốn xác ñịnh chất cần phân tích, người ta giải nó ra khỏi cột sắc ký bằng một hệ dung môi phù hợp (pha ñộng). Aureomycin bị pha ñộng tách ra khỏi cột sắc ký ra ngoài và ñược phát hiện bằng Detecto UV-VIS ở bước sóng 355nm. Nồng ñộ chất phân tích ñược xác ñịnh bằng phương pháp ñường chuẩn. Phương pháp này có thể tách và xác ñịnh ñồng thời 3 KS họ Tetracyclin.
( TCVN 5149-1990: Phương pháp xác ñịnh dư lượng Aureomycin)
1.8.2. Các phương pháp phân tích tồn dư Borax trong thịt
1.8.2.1. Phương pháp phát hiện Borax bằng giấy nghệ (Giấy Curcumin) [47]. Nguyên lý: Borax trong môi trường toan sẽ tạo thành Axit Boric (HBO3). Axit Boric sẽ làm cho giấy tẩm nghệ hoặc dung dịch nghệ chuyển màu vàng (Curcumin) thành màu ñỏ cam.
Đây là phương pháp test nhanh sự có mặt của Borax do các cơ quan trong và ngoài nước nghiên cứu. Hiện nay phương pháp này ñã ñược các phương tiện truyền thông truyền tải thông tin. Thậm chí, ñã có một vài cá nhân ñã hướng dẫn cách tạo ra giấy hoặc dung dịch nghệ tươi ñể kiểm tra Borax trong thực phẩm hằng ngày. Hiện nay trên thị trường Việt Nam còn xuất hiện nhiều công cụ Quick test Borax: bộ Kit test Borax của Thái Lan, bộ Kit test Borax của Phùng
Văn Trung, Phòng "Hóa Công nghệ các Hợp chất Thiên nhiên"- Viện Công nghệ Hoá học Thành phố Hồ Chí Minh ... các công cụ này cũng dựa trên nguyên lý sự ñổi màu của Curcumin ñược tẩm trong giấy hoặc tăm bông khi có mặt của Borax trong môi trường axit.
1.8.2.2. Phương pháp kiểm tra Borax trong thịt lợn bằng thuốc thử của Trung tâm Kiểm tra Vệ sinh Thú y Trung ương 2 (TTKTTYTWII) [37]
Nguyên lý: Borax trong thịt sẽ tạo thành Acid Boric trong môi trường pH thích hợp. Acid Boric phản ứng với làm chuyển màu acid Carminic trong thuốc thử từ ñỏ tươi thành màu ñỏ thẫm hơi tím hoặc thành màu xanh tím (tùy thuộc vào nồng ñộ Borax ít hay nhiều).
Chương II: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
- Các hộ chăn nuôi lợn; Mẫu thịt lợn lấy tại nơi giết mổ và tại các quầy buôn bán lẻ của các chợ trung tâm (vào lúc 6-7 giờ và 14-16 giờ trong ngày).
- Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 12/2009 ñến tháng 6/2010.
- Địa ñiểm nghiên cứu: Tại huyện Ea H’leo – tỉnh Đắk Lắk; Phòng thí nghiệm Bộ môn Cơ sở thú y - Khoa Chăn nuôi, Thú y - Trường Đại học Tây Nguyên; Trung tâm Kiểm tra An toàn Vệ sinh Thực phẩm miền Trung (Viện Pasteur Nha Trang).
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Tình hình chăn nuôi lợn tại huyện Ea H’leo - Đắk Lắk
- Tình hình sử dụng KS và các chế phẩm chứa KS trong chăn nuôi lợn. - Tình hình và mức ñộ tồn dư KS trong thịt lợn tại huyện Ea H’leo - Đắk
Lắk
- Tình hình dư lượng Borax trong thịt lợn tại huyện Ea H’leo - Đắk Lắk 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Sử dụng phương pháp nghiên cứu cắt ngang [4], [34].
2.3.1. Tình hình chăn nuôi lợn, tình hình sử dụng thuốc KS và các chế phẩm có chứa KS trong chăn nuôi lợn tại huyện Ea H’Leo tỉnh Đắk Lắk
- Điều tra số liệu thứ cấp từ cơ quan thú y và chính quyền cấp huyện thuộc phạm vi nghiên cứu.
- Điều tra tình hình chăn nuôi lợn và tình hình sử dụng thuốc KS từ các hộ chăn nuôi lợn Tại huyện Ea H’leo.
+ Sử dụng một số công cụ của phương pháp ñánh giá nhanh nông thôn (RRA) chọn 30% số xã/thị trấn trong huyện (huyện có 11 xã và 1 thị trấn): Chủ
ñộng chọn 1 thị trấn và chọn ngẫu nhiên 3 xã ñể nghiên cứu: Thị trấn Ea Đrăng, Xã Ea Sol, xã Ea Khal và xã Ea Ral.
+ Chọn ngẫu nhiên các hộ chăn nuôi lợn thuộc ñịa bàn ñã chọn. Số hộ ñược phỏng vấn là 81 (trong 23 thôn/buôn của 4 xã/thị trấn ñã chọn).
+ Nội dung phỏng vấn theo phiếu ñiều tra (phụ lục 2).
2.3.2. Tình hình tồn lưu KS trong thịt lợn huyện Ea H’leo.
* Thời ñiểm lấy mẫu: Ngay sau lúc mổ (chưa chuyển ra quầy bán lẻ) * Số lượng mẫu cần kiểm tra dư lượng KS: với các thông số:
. N: Số lợn hạ thịt trong ngày của các xã/ thị trấn ñã chọn trong thời gian tiến hành nghiên cứu = 50.
. p: tỉ lệ mẫu có tồn dư KS ở kết quả nghiên cứu trước [28] = 25,56% . d : Sai số cho phép = 5%.
. Độ tin cậy: 95%
. z = 1,96: giá trị phân phối chuẩn ở ñộ tin cậy 95%
. n: Số mẫu cần kiểm tra dư lượng KS. Áp dụng phần mềm hỗ trợ Win Episcope 2.0 ñể tính, n = 50 (Phụ lục 1); và tính theo công thức [4][tr.40] :
Số mẫu kiểm tra = Nz
2p(1-p) = 43 d2(N-1) + z2p(1-p)
Tại ñịa bàn huyện Ea H’leo hiện chưa có ñiểm giết mổ tập trung, mỗi hộ kinh doanh tự giết mổ gia súc theo ñịa ñiểm riêng (tại nhà hoặc gần chợ); Xã Ea Khal không có chợ, không có trung tâm mua bán (vì diện tích trải dài, ñối diện và gần sát với trung tâm thị trấn Ea Đrăng). Do ñó chúng tôi không tổ chức thu thập mẫu tại xã này. Số mẫu thịt cần kiểm tra KS là:
- Tại thị trấn Ea Đrăng : 31 mẫu
- Tại xã Ea Ral : 14 mẫu = 50 mẫu - Tại xã Ea Sol : 5 mẫu
* Cách chọn mẫu: Chọn 50 mẫu/50 ñầu lợn giết thịt tại nơi giết mổ (tỉ lệ mẫu: ñầu lợn = 1:1).
* Cách lấy mẫu: Lấy 100 g thịt nạc ñùi/1mẫu.
* Bảo quản mẫu: Mẫu ñược ñựng trong túi nilon sạch, ñánh số và ghi rõ nguồn gốc. Mẫu ñược bảo quản trong môi trường 10 – 15 oC; ñược chuyển về phòng thí nghiệm Bộ môn Cơ sở Thú y – Trường Đại học Tây Nguyên và sau ñó ñược chuyển ñến Trung tâm Kiểm tra An toàn Vệ sinh Thực phẩm miềm Trung thuộc viện Pasteur Nha Trang ñể phân tích dư lượng KS.
* Phương pháp phân tích dư lượng KS nhóm Tetracycline: Dùng phương pháp phân tích sắc ký lỏng hiệu nâng cao (HPLC) theo tiêu chuẩn AOAC 995.09
Nguyên tắc
- Các KS Nhóm KS Tetracycline trong các mô cơ của sinh vật ñược tách chiết bằng dung dịch ñệm có môi trường pH = 4. Dịch chiết xuất ñược làm sạch bằng phương pháp chiết pha rắn trên cột tách chiết C18. Tetracyclines ñược tách và ñịnh lượng bởi hệ thống sắc kí lỏng hiệu năng cao nhờ cột C8 và Deletor UV với bước sóng là 350 nm.
- Chi tiết về phương pháp phân tích dư lượng KS nhóm Tetracycline ñược trình bày ở phần phụ lục 3.
2.3.3. Tình hình tồn dư Borax trong thịt lợn tại huyện Ea H’Leo.
- Điều tra sự nhận thức ñối với Borax: phỏng vấn 81 hộ nuôi lợn trên ñịa bàn ñã chọn bằng phiếu ñiều tra 2 (Phụ lục 2)
- Điều tra tồn dư Borax trong thịt lợn * Thời ñiểm lấy mẫu:
- Ngay sau lúc hạ thịt. Kí hiệu n1.
- Tại các quầy bán lẻ của các chợ trung tâm (thuộc các ñịa phương ñã chọn) lúc 6-7 giờ và 14-16 giờ trong ngày. Số lượng mẫu lần lượt kí hiệu n2 và n3.
* Số lượng mẫu kiểm tra dư lượng Borax: n = n1 + n2 + n3 n1 = 50
n2 và n3 ñược tính bằng phần mềm Win Episcope 2.0 (phụ lục 1), hoặc tính theo công thức:
[2][tr.40] Với: N: Số quầy bán lẻ trong ngày của các chợ trung tâm thuộc xã/thị trấn ñã chọn: tại thời ñiểm 6-7 giờ có 40 quầy bán lẻ; Tại thời ñiểm 14-16 giờ cùng ngày có 17 quầy bán lẻ.
. p: tỉ lệ mẫu có tồn dư Borax ở kết quả nghiên cứu trước (Nguyễn Thị Oanh-Tạ Đức Thịnh và cộng sự (2009): Lúc 6-7 giờ là 14,28%; Lúc 14-16 giờ là 71,42%; Trung bình trong ngày 42,85%.
. d : Sai số cho phép = 5% . Độ tin cậy: 95%
. n = Số mẫu cần lấy tại các quầy bản lẻ vào thời ñiểm 6-7 giờ và 14-16 giờ cùng ngày.
- Tính theo công thức: n2 = 33 và n3 = 16 - Theo Win Episcope 2.0: n2 = 40 và n3 = 17 - Chúng tôi ñã chọn: n2 = 40 và n3 = 17
- Số mẫu kiểm tra Borax là: n = n1 + n2 + n3 = 50 + 40 + 17 = 107 mẫu * Cách chọn mẫu:
- Chọn 50 mẫu/50 ñầu lợn bị hạ thịt tại nơi giết mổ
- Chọn 40 mẫu/40quầy bán lẻ vào thời ñiểm 6-7 giờ và 17 mẫu/17 quầy bán lẻ vào thời ñiểm 14-16 giờ cùng ngày.
* Cách lấy mẫu: Lấy 30 g thịt nạc bề mặt với ñộ dày là 1-2 cm.
Số mẫu kiểm tra = Nz
2p(1-p) d2(N-1) + z2p(1-p)
* Bảo quản mẫu: Mẫu ñược ñựng trong túi nilon sạch, ñánh số và ghi rõ nguồn gốc. Mẫu ñược bảo quản trong môi trường 10 – 15 oC, ñược chuyển về phòng thí nghiệm Bộ môn Cơ sở Thú y – trường Đại học Tây Nguyên và sau ñó chuyển ñến Trung tâm Kiểm tra An toàn Vệ sinh Thực phẩm miền Trung thuộc Viện Pasteur Nha Trang ñể phân tích dư lượng Borax.
* Phương pháp kiểm tra ñịnh lượng Boax của Trung tâm Kiểm tra An toàn Vệ sinh Thực phẩm miền Trung theo quyết ñịnh 3390/2000/QĐ-BYT.
Nguyên lý:
- Mẫu thực phẩm ñược acid hoá bằng Acid hydrocloric, sau ñó ñem ñun nóng trên nồi cách thuỷ, Acid boric (H3BO3) hoặc Natri borat (Na2B4O7) ñược phát hiện bằng giấy nghệ. Sự có mặt của H3BO3 hoặc Na2B4O7 sẽ chuyển màu vàng của giấy nghệ sang màu ñỏ cam.
- Chi tiết về phương pháp kiểm tra dư lượng Borax ñược trình bày ở phần