2/
3.5 Các phương pháp nghiên cứu
3.5.1 Phương pháp vi sinh
3.5.1.1 Phương pháp đếm khuẩn lạc phát triển trên mơi trường thạch
Nguyên tắc: cấy chính xác một thể tích mẫu (hoặc dịch pha lỗng) lên trên bề mặt mơi trường thạch. Từ mỗi độ pha lỗng lấy lặp lại ít nhất là 2 hộp và mỗi mẫu cần làm ít nhất 2 độ pha lỗng liên tiếp để làm sao trên mỗi hộp cĩ từ 30 đến 300 khuẩn lạc. Nuơi cấy trong điều kiện thích hợp cho các vi sinh vật phát triển, sau đĩ đếm số lượng các khuẩn lạc mọc trên mơi trường thạch.
Ta tiến hành như sau:
Đầu tiên chuẩn bị mơi trường thích hợp và dịch pha lỗng, sau đĩ khử trùng cùng với các dụng cụ cần dùng, pha lỗng mẫu đến nồng độ cần thiết. Sau đĩ cấy mẫu trên mơi trường thạch: rĩt khoảng 15-18ml mơi trường sau khi hấp khử trùng để nguội 450 vào mỗi đĩa Petri đã vơ trùng. Sau đĩ để thạch nguội đem ủ ở nhiệt độ 300C trong 2-3 ngày để kiểm tra độ vơ trùng của chúng.
Nhân giống cấp 2
Lên men chính theo thời gian tối ưu
Điều chỉnh về pH tối ưu
Rượu bưởi Bổ sung tỷ lệ tối ưu
Đưa một cách vơ trùng một thể tích 0,05-0,1ml mẫu đã pha lỗng đến nồng độ cần thiết lên bề mặt thạch. Dùng que trang vơ trùng dàn đều thể tích này lên khắp bề mặt mội trường. Lật hộp lại và đem ủ trong tủ ủ ở 320C trong 48h, sau đĩ tiến hành đếm số lượng các khuẩn lạc mọc trên mỗi đĩa[8].
Số lượng vi sinh vật trung bình cĩ trong 1ml mẫu được tính theo cơng thức:
v f n n C N × × + = ∑ 1 2 1 0,1 ) ( Trong đĩ:
N- số khuẩn lạc cĩ trong 1ml mẫu
∑C- tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa n1- số đĩa đếm ở nồng độ pha lỗng thứ nhất
n2- số đĩa đếm ở nồng độ pha lỗng thứ hai
f1- hệ số pha lỗng của đĩa ở nồng độ pha lỗng thứ nhất v- thể tích mẫu cấy vào mỗi đĩa Petri
3.5.1.2 Phương pháp đếm bằng buồng đếm hồng cầu
Tế bào nấm men cĩ kích thước tuơng đối lớn nên cĩ thể đếm trực tiếp số tế bào bằng buồng đếm hồng cầu.
Cấu tạo buồng đếm hồng cầu: buồng đếm là một phiến kính dày hình chữ nhật, giữa là phần lõm phẳng cĩ kẽ một lưới gồm 400 ơ vuơng cĩ diện tích tổng cộng là 1mm2. Ơ vuơng trung tâm được khoanh trịn gồm 25 ơ, trong mỗi ơ cĩ 16 ơ nhỏ, chiều sâu mỗi ơ nhỏ là 0.1mm, diện tích một ơ là 0.0025mm2. Khi đếm ta cĩ thể đếm ở 5 ơ vuơng theo đường chéo hoặc 4 ơ ở 4 gĩc và ơ trung tâm [8].
Mật độ tế bào được tính theo cơng thức sau:
16: Số ơ nhỏ trong 1 ơ lớn
5: Số ơ lớn được đếm trong ơ trung tâm 10-3: Đổi từ mm3 sang ml.
3.5.2 Phương pháp hĩa sinh
3.5.2.1 Phương pháp định lượng đường tổng
Pha dung dịch saccharose 0,1% ( cân 500mg saccharose, sấy khơ ở 600C hịa tan trong 500ml nước cất)
Pha các dung dịch đường với hàm lượng khác nhau: lấy 7 bình định mức 100ml rồi cho vào đĩ theo thứ tự 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ml dung dịch saccharose 0,1% ở trên, cho nước cất tới vạch mức.
Pha phelnol 5%: cân 5g phenol trong 100ml nước cất.
Hút từ 7 dung dịch đường đã pha ở trên mỗi dung dịch 1ml cho vào ống nghiệm, lấy 1ml dung dịch phenol 5% và 5ml dung dịch H2SO4 đậm đặc, để phản ứng trong 10 phút rồi lắc, để cách thủy 10-20 phút ở 25-300C, khi màu bền trong vài giờ thì tiến hành đi đo OD ở bước sĩng 490nm. Ta dựng được đồ thị chuẩn, làm tương tự với mẫu cần xác định đường tổng ta sẽ xác định được giá trị đường tổng [8].
3.5.2.2 Phương pháp đo độ cồn
Dùng bình tỷ trọng:
Đầu tiên rửa sạch bình tỷ trọng, sấy khọ và làm lạnh trong bình hút ẩm, sau đĩ đem cân bình khơng ta được m1 gam.
Tiếp theo rĩt nước cất vào bình đến trên ngấn định mức, đặt bình vào nồi cách thủy cĩ nhiệt độ 200C. Sau 15 phút dùng giấy lọc thấm nước tới ngấn bình đồng thời thấm khơ phần khơng chứa nước, lau khơ nút và đậy lại. Lấy bình ra khỏi nồi điều nhiệt, lau khơ phía ngồi bình rồi đem cân ta được m2 gam. Tiếp theo đổ nước khỏi bình, tráng bình 2 đến 3 lần bằng dung dịch cần đo tỷ trọng rồi cũng rĩt chất lỏng tới trên vạch, sau đĩ làm tương tự như khi bình chứa nước cất, cân được khối lượng m3
gam. Tính d20
20, tra phụ lục ta biết được nồng độ rượu cần đo [9].
d20 20 = 1 2 1 3 m m m m − −
3.5.2.3 Phương pháp định lượng acid
Nguyên tắc: dựa trên phản ứng trung hịa các acid cĩ trong mẫu bằng dung dịch kiềm NaOH 0,1N với chất chỉ thị là phenolphtalein. Từ lượng dịch kiềm tiêu hao, ta tính đượng acid tổng số cĩ trong mẫu [9].
Hàm lượng acid tổng (tính theo g acid trên 1 lít (g/l)) được tính theo cơng thức:
V K
n
Ax =( × ×1000)/ , g/l. Trong đĩ:
Ax: lượng acid cĩ trong 1 lít sản phẩm, g/l;
n: số ml NaOH 0,1N tiêu hao khi định phân mẫu thực, ml; V: lượng mẫu mang đi phân tích.
K: số g acid tương ứng với 1ml NaOH 0,1N. (Với: Acid citric K=0,0064).
3.5.2.4 Phương pháp định lượng vitamin C
Nguyên tắc: Acid L-ascorbic cĩ tính khử mạnh được oxy hĩa bằng dung dịch I2
với chỉ thị là dung dịch tinh bột. Điểm kết thúc của phản ứng nhận biết được nhờ chỉ thị dung dịch tinh bột. Đây là phương pháp xác định nhanh và cho kết quả gần đúng.
Tiến hành: Lấy 10ml dịch quả cho vào bình tam giác 250ml, cho 5ml dung dịch H2SO4 và thêm vài giọt tinh bột, lắc nhẹ rồi chuẩn độ bằng I2 0,01N tới khi bắt đầu xuất hiện màu xanh [9].
Kết quả: Lượng vitamin C được tính theo cơng thức sau: Hàm lượng vitamin C=
V n×0,88×1000
, mg/l.
Đánh giá cảm quan là kỹ thuật sử dụng các cơ quan cảm giác của con người để nhận biết, mơ tả và định lượng các tính chất cảm quan của một sản phẩm như màu sắc, hình thái, mùi, vị và cấu trúc. Ở đây chúng tơi sử dụng phương pháp cho điểm chất lượng tổng hợp của sản phẩm để đánh giá về chất lượng cảm quan của sản phẩm rượu bưởi.
Phương pháp cho điểm:
Phương pháp cho điểm được sử dụng để đánh giá tổng quát mức chất lượng của một sản phẩm so với tiêu chuẩn hoặc so với một sản phẩm cùng loại trên tất cả các chỉ tiêu cảm quan: màu sắc, mùi, vị và trạng thái. Tình trạng chất lượng của mỗi chỉ tiêu được đánh giá bằng điểm. Giá trị điểm tăng theo mức tăng của chất lượng sản phẩm. Do các chỉ tiêu cĩ vai trị đối với chất lượng chung của sản phẩm ở mức khác nhau nên các giá trị cho được đối với mỗi chỉ tiêu được nhân thêm một giá trị tương ứng gọi là hệ số trọng lượng. Các chỉ tiêu cĩ vai trị lớn hơn thì cĩ hệ số trọng lượng cao hơn. Tổng điểm của các chỉ tiêu là điểm chất lượng của sản phẩm. Điểm này quyết định mức chất lượng của sản phẩm được đánh giá [13].
Bảng 3.1: Bảng điểm đánh giá các chỉ tiêu của sản phẩm rượu bưởi (TCVN 3217 – 79)
Tên chỉ tiêu Điểm chưa cĩ
trọng lượng Yêu cầu
Độ trong và màu sắc
5 Trong, khơng vẩn đục, màu vàng nhạt sáng, màu hồn tồn đặc trưng cho sản phẩm.
4 Trong, khơng vẩn đục, màu vàng nhạt.
3 Trong, màu hơi khác một ít so với màu đặc trưng của sản phẩm, màu vàng.
2 Hơi đục, màu khơng đặc trưng cho sản phẩm, màu vàng sậm.
1 Đục nhiều, lắng cặn, màu khơng đặc trưng cho sản phẩm, màu vàng sậm đen.
0 Vẩn đục, màu bẩn, sản phẩm bị hỏng, cĩ xuất hiện màu lạ
Mùi
5 Hịa hợp, thơm dịu, hồn tồn đặc trưng cho sản phẩm.
4 Chưa hồn tồn hịa hợp, thơm đặc trưng cho sản phẩm nhưng hơi khĩ nhận thấy.
3 Hơi nồng, ít đặc trưng cho sản phẩm.
2 Nồng, thoảng mùi lạ, rất ít đặc trưng cho sản phẩm.
1 Nồng, hăng, mùi lạ rõ, khơng đặc trưng cho sản phẩm.
0 Cĩ mùi lạ khĩ chịu của sản phẩm hỏng.
Vị
5 Hịa hợp, yêm dịu, hậu vị tốt, hồn tồn đặc trưng cho sản phẩm.
4 Chưa hồn tồn hịa hợp, hậu vị vừa phải, hồn tồn đặc trưng cho sản phẩm bình thường. 3 Chưa hịa hợp, hơi gắt và sốc, hậu vị yếu, ít đặc
Mẫu phiếu đánh giá cảm quan theo phép thử cho điểm:
PHIẾU ĐÁNH GIÁ CẢM QUAN
Tên sản phẩm: Rượu bưởi. Ngày .. Tháng .. Năm .. Họ tên người kiểm tra:……… Chữ ký:…….
Rượu bưởi được đánh giá cảm quan qua 4 chỉ tiêu với các hệ số trọng lượng như sau:
Bảng 3.2: Hệ số trọng lượng của các chỉ tiêu
Chỉ tiêu Hệ số trọng lượng Độ trong và màu sắc Mùi Vị 0,8 1,2 2
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
4.1 Khảo sát một số đặc điểm sinh học của giống Saccharomyces cerevisae F28 Quan sát vi thể và đại thể tế bào nấm men:
Các chỉ tiêu Điểm (0-5) Nhận xét Màu Mùi Vị Trạng thái
Để quan sát hình thái tế bào nấm men ta tiến hành nhuộm đơn tế bào nấm men bằng cách làm tiêu bản giọt ép với thuốc nhuộm fushin. Kết quả chúng tơi quan sát được nấm men Saccharomyces cerevisae F28 cĩ cấu tạo đơn bào, hình trứng, kích thước tương đối lớn.
Tiếp theo để khảo sát tính thuần
của giống chúng tơi tiến hành cấy ria, trải đĩa và tiến hành quan sát khuẩn lạc sau khi ủ được 2 ngày ở nhiệt độ 320C. Quan sát khuẩn lạc sau khi ủ chúng tơi nhận thấy giống Saccharomyces cerevisae F28 nhận được từ phịng thí nghiệm trường Đại Học Bách Khoa là giống thuần. Khuẩn lạc cĩ màu trắng, mọc lồi trên mơi trường thạch, đường kính vào khoảng 1,5-2mm.
Chủng Saccharomyces cerevisae F28 được bảo quản để sử dụng trong suốt quá
Hình 4.1 : Tế bào nấm men quan sát dưới kính hiển vi
(a) Trải đĩa (b) Cấy ria Hình 4.2: Khuẩn lạc của
Bưởi sau khi ép tiến hành khảo sát các chỉ tiêu: pH, đường khử, đường tổng, acid citric, vitamin C. Thí nghiệm được thực hiện tại phịng thí nghiệm hĩa sinh, thí nghiệm lặp lại 3 lần, kết quả là giá trị trung bình của 3 lần lặp.
Bảng 4.1: Kết quả xác định một số chỉ tiêu của bưởi Năm Roi tại phịng thí nghiệm Chỉ tiêu Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình pH 4,05 4,05 4,05 4,05 Aci tổng(g/l) 5,41 5,42 5,41 5,41 Đường tổng (%) 2,56 2,56 2,57 2,56 Đường khử(%) 3,85 3,85 3,85 3,85 Vitamin C 572 563,2 572 572
Kết quả từ bảng 4.1 cho thấy độ acid và độ pH của nguyên liệu tương đối phù hợp với khả năng lên men của nấm men. Hàm lượng đường tổng, đường khử tương đối thấp khơng thuận lợi cho quá trình lên men. Do đĩ trong quá trình lên men cần bổ sung và điều chỉnh hàm lượng đường thích hợp để quá trình lên men đạt hiệu quả.
4.3 Kết quả quá trình lên men rượu
4.3.1 Thí nghiệm khảo sát độ pha lỗng của dịch bưởi trước khi lên men rượu
Dịch bưởi sau khi ép tiến hành kiểm tra các thơng số: 0Bx, pH, acid tổng, đường tổng, cảm quan. Sau đĩ tiến hành pha lỗng mẫu và kiểm tra các thơng số như trên để từ đĩ chọn ra độ pha lỗng thích hợp nhằm đạt hiệu quả cao trong các quá trình lên men sau này.
Ở đây chúng tơi tiến hành pha lỗng dịch bưởi ở các độ pha lỗng: 1:0; 1:1; 1:2; 1:3; 1:4 (dịch bưởi : nước). Dịch bưởi sau khi pha lỗng tiến hành kiểm tra các thơng số và thu được kết quả trong bảng sau:
Bảng 4.2: Ảnh hưởng của độ pha lỗng của dịch bưởi đến quá trình lên men rượu
Độ pha lỗng (dịch bưởi : nước) 1:0 1:1 1:2 1:3 1:4 Hàm lượng chất khơ (0Bx) 12 6 4 3 2 Đường tổng(g/l) 0,213 0,190 0,141 0,132 0,130 pH 4,05 4,1 4,12 4,27 4,3 Acid tổng(g/l) 7,68 3,45 1,85 1,34 1,12
Từ kết quả nhận được ở bảng 4.2 chúng tơi nhận thấy đối với dịch bưởi càng pha lỗng thì hàm lượng đường tổng thấp, 0Bx càng thấp. Đối với dịch bưởi nguyên chất thì cĩ mùi thơm dịu của bưởi, vị chua ngọt hài hịa, 0Bx cao, hàm lượng đường cao. Dịch bưởi sau khi pha lỗng thì hàm lượng đường giảm, 0Bx thấp, vị nhạt. Xét các thơng số ảnh hưởng đến quá trình lên men rượu thì ứng với dịch bưởi nguyên chất và dịch bưởi pha lỗng theo tỷ lệ 1:1 là thích hợp để tiến hành lên men rượu.
Tuy nhiên xét về tính kinh tế thì chúng tơi chọn dịch bưởi pha lỗng theo tỷ lệ 1:1 để tiến hành lên men cho những thí nghiệm sau là hợp lý và hiệu quả.
4.3.2 Thí nghiệm khảo sát thời gian lên men chính rượu bưởi
Sau khi kết thúc quá trình lên men chính nấm men thường giảm hoặc ngừng phân giải đường thành rượu và khí CO2, lúc này hầu hết tế bào nấm men sẽ chết và xảy ra hiện tượng tự phân làm tăng chất dinh dưỡng. Đây là điều kiện thuận lợi cho vi sinh vật xâm nhiễm và phát triển. Do đĩ việc xác định thời gian lên men thích hợp là rất quan trọng nhằm tiết kiệm thời gian lên men, hạn chế vi sinh vật tạp nhiễm cũng như thu được độ rượu cao.
Dịch bưởi sau khi ép tiến hành pha lỗng theo tỷ lệ 1:1, điều chỉnh 0Bx=20, chỉnh pH về pH=4,5, bổ sung Na2SO3 với hàm lượng 50mg/l. Sau đĩ bổ sung giống với tỷ lệ 10% tiến hành lên men và kiểm tra các thơng số 0Bx, pH, acid tổng, đường
Dựa vào kết quả ghi nhận được chúng tơi thấy theo thời gian hàm lượng chất khơ và đường tổng giảm dần. Điều này chứng tỏ nấm men đã sử dụng đường làm cơ chất để sinh trưởng và phát triển và tạo ra sản phẩm là khí CO2, các acid hữu cơ và độ rượu.
Ban đầu pH giảm dần theo thời gian từ ngày đầu tiên đến ngày thứ tư, sau đĩ từ ngày thứ năm trở đi pH lại tăng lên. Điều này cĩ thể giải thích như sau: trong quá trình lên men nấm men sử dụng cơ chất để sinh trưởng phát triển tạo ra sản phẩm là cồn, CO2, và các acid hữu cơ. Thời gian đầu nấm men sinh trưởng phát triển mạnh nên lượng CO2 và các acid hữu cơ tạo ra nhiều làm cho pH giảm. Bên cạnh đĩ lượng acid tổng cũng tăng lên.
Từ ngày thứ 5 trở đi chúng tơi nhận thấy pH lại cĩ xu hướng tăng lên, điều này cĩ nghĩa là lượng CO2 tạo ra khơng cịn nhiều như lúc đầu, hơn nữa lượng CO2 ban đầu cũng được xả bỏ bớt để tránh hiện tượng vỡ bình và lượng CO2 nhiều quá sẽ ức chế nấm men phát triển, do đĩ mà pH mơi trường cĩ xu hướng tăng nhẹ.
Dựa vào bảng 4.3 và biểu đồ 4.1 chúng tơi nhận thấy từ ngày đầu tiên đến ngày thứ tư hàm lượng đường tổng, hàm lượng chất khơ giảm mạnh, đồng thời nồng độ rượu tăng mạnh đến ngày thứ năm. Từ ngày thứ năm trở đi hàm lượng đường tổng giảm dần và nồng độ rượu tăng dần đến ngày thứ bảy thì nồng độ rượu đạt được là cao nhất. Thời gian(ngày) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Hàm lượng chất khơ (0Bx) 20 15 11 8 7 6 5 5 5 pH 4,5 4,03 3,80 3,61 3,59 3,80 3,86 3,88 4,0 Đường tổng (g/l) 130,5 50,11 40,21 20,33 3,55 3,23 2,95 2,84 2,82 Acid tổng (g/l) 3,45 3,85 4,10 4,50 4,71 4,42 4,29 4,12 4,08 Độ rượu (%V) 0 3,1 6,23 8,0 9,0 10,23 10,85 11 11 20 15 11 8 7 6 5 5 5 0 3,1 6,23 8 9 10,23 10,85 11 11 0 5 10 15 20 25
Từ kết quả thu được ở trên chúng tơi cĩ thể kết luận thời gian lên men chính tốt nhất là 7 ngày. Đây là cơ sở để tiến hành lên men cho những thí nghiệm sau.
4.3.3 Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của pH ban đầu đến khả năng lên men của dịch bưởi của dịch bưởi
Nồng độ H+ của mơi trường cĩ ảnh hưởng rất lớn đến hoạt động của nấm men.