1.10.2.1 Các chủng virut Rota được cân nhắc để phát triển vắc xin
Bệnh viêm dạ dày ruột do virut Rota là nguyên nhân hàng đầu dẫn đến căn bệnh tiêu chảy ở trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ trên toàn thế giới. Hiện nay chƣa có biện pháp hiệu quả nào để thanh toán hoàn toàn bệnh do nhiễm virut Rota hay sự lây truyền của nó. Điều đó cho thấy tầm quan trọng của việc phát triển các văcxin ngăn chặn căn bệnh này. Các chủng virut Rota của ngƣời và động vật đƣợc cân nhắc sử dụng nhƣ các nhà tài trợ gen để phát triển văcxin đƣợc đề cập tới ở bảng sau:
Bảng 5. Các chủng virut Rota đƣợc cân nhắc để phát triển vắc xin [6]
Chủng virut Kiểu hình
Virut rotaở bò, WC3 G6P5
Virut rota ở ngƣời:
W179 G1P8
SC2 G2P6
W178 G3P8
WI61 G9P8
Tạo các chủng mới từ việc sắp xếp lại gen của chủng WC3 (Các gen virut Rota ngƣời đã đƣợc thay thế):
W 179- 9 ( 9 từ W179) G1P5 SC2 - 9 ( 9 từ SC2) G2P5 D7A (1,3,5 - 9 từ SC2) G2P5 WC3 (2-5) ( 1,6 - 11 từ W178) G3P5 W178 - 8 ( 8 từ W178) G3P5 W179 - 4 ( 4 từ W 179) G6P8 WI61 - 4( 4 từ WI61) G6P8 W179 (4, 1,9) ( 4,1,9 từ W179) G1P8
Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Phương Thuý
Những nghiên cứu nhằm phát triển một văcxin virut Rota an toàn và hiệu quả đã bắt đầu từ giữa những năm 1970. Bệnh do virut Rota thƣờng liên quan đến nhiễm trùng biểu mô đƣờng ruột, do vậy việc phát triển văcxin bảo vệ là quá trình tìm ra kháng nguyên có khả năng tạo đáp ứng miễn dịch đặc hiệu với virut. Ngƣời ta đã hy vọng rằng một văcxin virut Rota sống, giảm độc lực sẽ là văcxin hiệu quả nhất.
1.10.2.2Các loại văc xin được nghiên cứu và sử dụng
a. Các loại vắc xin trên thế giới
Ứng cử viên văcxin virut Rota đầu tiên là các văcxin đơn giá "Monovalent vaccines" sử dụng chủng virut Rota WC3 đƣợc phân lập từ vật chủ là bò hoặc từ khỉ Rhesus. Đây là loại văcxin sống giảm độc uống một liều duy nhất. Văcxin này an
toàn và có thể ngăn chặn đƣợc bệnh tiêu chảy do virut Rota ở trẻ em [6] . Văcxin thứ hai là các văcxin đa giá "Multivalent vaccines" đƣợc sản xuất
năm 1985 bằng cách sử dụng sự thay thế gen [6]. Một gen trong hệ gen của chủng virut Rota động vật đƣợc thay thế bởi gen của virut Rota ngƣời, gen này mã hoá cho protein VP7.
Rota Shield là vacxin tứ liên "Tetravalent vaccines" đƣợc phát triển bởi chủng virut rota MMU18006, là văcxin sống giảm độc lực uống đƣợc sản xuất từ chủng virut Rota ở khỉ Rherus. Vacxin này đƣợc cấp phép tháng 10 năm 1998 tại Mỹ, 600.000 trẻ đƣợc sử dụng vắc xin tƣơng đƣơng với 1,2 triệu liều. Văcxin này bị đình chỉ sử dụng vì có liên quan đến tăng nguy cơ lồng ruột sau 3 tuần sử dụng liều đầu tiên với tỷ lệ ƣớc tính 1/10.000 liều.
Vắc xin dòng sơ sinh, bác sĩ Ruth Bishop đã phát triển chủng này trong phòng thí nghiệm của bà. Chủng này là chủng virut Rota ngƣời (G3, P6) đƣợc phân lập từ một trẻ sơ sinh và làm giảm độc lực qua nhiều lần cấy truyền. Vắc xin này có thể tạo ra khả năng phòng bệnh đồng týp chống lại dòng G1[6].
Vắc xin đƣợc tạo ra trong phòng thí nghiệm nghiên cứu của Merck. Văcxin phối hợp dựa trên chủng của ngƣời và bò (WC) tạo ra khả năng phòng chống bệnh rất tốt (70%) và phòng bệnh tiêu chảy cấp nặng (95-100%). Văcxin này là văcxin 5 týp phối hợp chủng của ngƣời (G1, G2, G3, G4 và P1(8) và chủng của bò(WC3).
Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Phương Thuý
Vắc xin của hãng Glaxo Smith Kline, bác sĩ Georges Thiry đƣa ra những kế hoạch về phát triển văcxin rota của hãng này, ứng cử viên của họ là chủng G1P[8]. Hiện nay văcxin này đã đƣợc cấp phép sử dụng tại Mexico. Vắc xin này đã đƣợc thử thực địa tại Singapore, sử dụng 2 liều vào tháng tuổi thứ 2 và 3 của trẻ. Với thời gian sử dụng văcxin này tránh tăng nguy cơ lồng ruột của trẻ và những tác dụng phụ khác.
b. Vắc xin Rota đã được phê chuẩn sử dụng
Hội nghị về virut Rota quốc tế lần thứ 6 đƣợc tổ chức ngày 7, 8 tháng 1 năm 2005 tại Mexico đã thông qua và phê chuẩn 2 vắc xin Rota đó là vắc xin RotaTeq của Meck và vắc xin Rotarix của Smith Line, cả hai vắc xin này đã đƣợc WHO phê chuẩn cho sử dụng tháng 1/2006 [6].
Rota Teq là văcxin sống uống giảm độc lực sử dụng 3 liều đƣợc bắt đầu nghiên cứu từ 1991. Nó là văcxin phối hợp giữa chủng rota của ngƣời và bò, chứa 5 kháng nguyên G1, G2, G3, G4 và P1. Thực địa lâm sàng chỉ ra rằng vacxin này rất an toàn và hiệu lực, nó phòng đƣợc >70% sự xâm nhập của bất kỳ týp virut Rota nào.
Rotarix là văcxin sống giảm độc lực đƣợc sử dụng 2 liều, có nguồn gốc từ 1 chủng virut Rota ngƣời G1P[8]. Kết quả thử nghiệm cho thấy khoảng 73% phòng đƣợc viêm dạ dày ruột do bất kỳ týp virut Rota nào và > 90% chống lại nhiễm cấp tính do virut Rota và đặc biệt văcxin này có hiệu lực phòng bệnh >83% do virut Rota không phải do týp G1, không có dấu hiệu chỉ ra rằng lồng ruột ở trẻ em liên quan đến việc sử dụng văcxin này.
c. Vắc xin sản xuất tại Việt Nam
Vắc xin Rotavin-M1 sản xuất từ chủng G1P[8] – WS (KH0118) đƣợc phân lập tại Việt Nam đã đƣợc sản xuất và thử nghiệm lâm sàng trên 30 ngƣời lớn khỏe mạnh [1], thời gian từ 8/2009 đến 10/2009, và trên 799 trẻ khỏe mạnh từ 6-12 tuần tuổi (thời gian từ 04/2010 đến 12/2011), kết quả thu đƣợc là đạt yêu cầu về mức độ an toàn trên ngƣời lớn và trẻ từ 6 – 12 tuần tuổi.
Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Phương Thuý
1.11 CÁC PHƢƠNG PHÁP CHUẨN ĐOÁN VIRUT ROTA
Có thể nuôi cấy trên tế bào thận của bào thai ngƣời, tế bào thận khỉ, tế bào thận bò... tuy nhiên việc nuôi cấy virut rota trên tế bào còn gặp nhiều khó khăn nên chỉ sử dụng trong nghiên cứu vì vậy ngƣời ta phải dùng các phƣơng pháp khác để chẩn đoán.
1.11.1 Các kỹ thuật phát hiện virut Rota.
- Kỹ thuật miễn dịch gắn enzym (ELISA) xác định kháng nguyên virut rota
Phƣơng pháp này dựa trên nguyên tắc sử dụng kháng thể đơn dòng để tìm ra kháng nguyên virut Rota có trong mẫu phân ngƣời [28]. Kỹ thuật miễn dịch enzym là một phƣơng pháp đơn giản, có độ nhạy cao dùng cho việc xác định kháng nguyên virut rota, và rất phù hợp cho việc phân tích một lƣợng mẫu lớn [6].
- Kỹ thuật RT-PCR xác định týp virut rota
PCR đƣợc sử dụng để xác định kiểu gen của virut rota dựa trên các ARN đƣợc tách chiết từ các mẫu phân có virut rota dƣơng tính, nhằm xác định đặc điểm của các protein capsit lớp ngoài G và P [6].
- Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang xác định kháng nguyên virut rota
Để xác định hiệu giá của virut nhóm A, có 2 phƣơng pháp xác định đó là phƣơng pháp miễn dịch enzym (EIA) với kết quả là chỉ số OD, chỉ số này không có ý nghĩa quyết định liều gây nhiễm của virut. Phƣơng pháp miễm dịch huỳnh quang là phƣơng pháp tối ƣu xác định hiệu giá virut Rota nhóm A, đơn vị xác định hiệu giá là đơn vị huỳnh quang phát sáng của tế bào gây nhiễm trên ml hỗn dịch virut. Đây là phƣơng pháp đơn giản, dễ thực hiện, cho kết quả nhanh trong vòng 24 giờ và chính xác [6]
- Kỹ thuật kính hiển vi điện tử
Đây là phƣơng pháp phát hiện trực tiếp virut trong bệnh phẩm và là kỹ thuật chẩn đoán nhanh, đặc hiệu, tuy nhiên độ nhạy không cao và khá đắt tiền, rất khó thực hiện khi có nhiều bệnh phẩm [6].
Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Phương Thuý
- Kỹ thuật ngưng kết hạt Latex
Hạt latex đƣợc gắn với kháng thể kháng virut Rota để chẩn đoán kháng nguyên của virut. Đây là kỹ thuật chẩn đoán nhanh, không cần nhiều trang thiết bị [27].
- Kỹ thuật điện di
Nguyên lý các mảnh kép phân tử ARN của virut rota có trọng lƣợng phân tử khác nhau nên dễ dàng tách ra khi điện di trên gel polyacrylamid hoặc agarose. Kỹ thuật này có độ nhạy, đặc hiệu cao, dễ áp dụng trên nhiều bệnh phẩm.
1.11.2 Các kỹ thuật phát hiện kháng thể virut Rota - Phản ứng kết hợp bổ thể - Phản ứng kết hợp bổ thể
Dùng kháng nguyên là virut Rota ngƣời tinh khiết, phân lập từ phân bệnh nhân để phát hiện kháng thể virut Rota [6].
- Phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu thụ động
Có thể dùng phản ứng này để định lƣợng IgG, phân biệt đƣợc lần nhiễm thứ nhất với lần nhiễm thứ hai. Phản ứng này nhạy hơn phản ứng kết hợp bổ thể [6].
Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Phương Thuý
6. CHƢƠNG 2
7. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
Đối tƣợng nghiên cứu là những trẻ em thỏa mãn các tiêu chí sau: - Độ tuổi từ 0 – 59 tháng tuổi (< 5 tuổi)
- Nhập viện với nguyên nhân TCC: đi ngoài ≥ 3 lần trong ngày (24h), phân lỏng, không máu
- Khởi bệnh ≤ 7 ngày.
2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1 Thiết kế nghiên cứu
a. Thời gian và địa điểm giám sát
Nghiên cứu đƣợc thực hiện từ tháng 1/2010 đến tháng 12/2010 tại bệnh viện Nhi Khánh Hòa.
b. Quy trình thực hiện
- Các mẫu phân của trẻ bị tiêu chảy cấp thỏa mãn đủ các tiêu chí đƣợc lấy mẫu trong vòng 48 giờ sau khi nhập viện. Mẫu sau khi lấy xong phải đƣợc bảo quản ở -200
C. - Tất cả các bệnh nhi đều có phiếu theo dõi ghi rõ các chỉ tiêu: tên, tuổi, giới tính, địa chỉ, ngày vào viện, ngày lấy bệnh phẩm, số thứ tự bệnh phẩm, các triệu chứng lâm sàng kèm theo.
- Hàng tháng, các cán bộ tập hợp các mẫu và biên bản ghi chép đầy đủ thông tin yêu cầu và gửi về phòng kiểm nghiệm thuộc Trung tâm nghiên cứu, sản xuất vắc xin và sinh phẩm y tế. Tất cả các mẫu này đều đƣợc chẩn đoán virut Rota bằng kit ELISA. Lựa chọn các mẫu dƣơng tính có chỉ số OD cao tiến hành tách chiết ARN và xác định kiểu gen G và P của virut Rota bằng phản ứng RT – PCR. Tổng hợp, phân tích số liệu dịch tễ học và đánh giá đặc tính các chủng virut Rota tại Việt Nam.
Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Phương Thuý
Hình 6. Sơ đồ tóm tắt quy trình thực hiện
2.2.2Phương pháp thực hiện
2.2.2.1 Lấy mẫu bệnh phẩm * Nguyên vật liệu: * Nguyên vật liệu:
Tất cả các mẫu phân của trẻ từ 0 đến 5 tuổi nhập viện do TCC vào các bệnh viện Nhi Khánh Hòa
Các ống nhựa vô trùng 15ml có nút đậy, nhãn, đá khô (ice – box)… Phích đá
Thiết bị tủ lạnh âm sâu -200
C để bảo quản mẫu. Phiếu điều tra
* Các bước tiến hành:
Ngƣời nhà bệnh nhi đƣợc hƣớng dẫn lấy mẫu vào ống nhựa vô trùng, dung tích 15ml có nút đậy, có nhãn ghi đầy đủ thông tin tên, tuổi, ngày lấy mẫu, số bệnh phẩm.Mẫu đƣợc bảo quản ở -200C sau đó đƣợc vận chuyển tới phòng kiểm nghiệm trong điều kiện đƣợc bảo quản lạnh.
Đối tượng nghiên cứu
Lấy mẫu nghiên cứu
Chẩn đoán bằng kỹ thuật ELISA
Mẫu âm tính Mẫu dương tính
Chọn mẫu có chỉ số OD cao
Tách ARN và chạy RT - PCR
Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Phương Thuý
Mỗi bệnh nhi đều có phiểu theo dõi ghi đây đủ các thông tin: tên, tuổi, giới tính, địa chỉ, ngày vào viện, ngày lấy bệnh phẩm, các triệu chứng lâm sàng, số lần tiêu chảy trong ngày, kéo dài bao lâu, tính chất phân, độ mất nƣớc, sốt, nôn…
2.2.2.2 Xác định virut Rota trong mẫu bệnh phẩm bằng phương pháp ELISA a. Nguyên lý của phương pháp
Hình 7. Sơ đồ mô tả nguyên lý của phƣơng pháp ELISA
Kháng thể gắn trên các giếng sẽ kết hợp với kháng nguyên có trong mẫu bệnh phẩm. Kháng nguyên này sẽ kết hợp với cộng hợp kháng thể gắn enzym tạo thành phức hợp Kháng thể – Kháng nguyên – Kháng thể gắn enzym. Khi có cơ chất của enzym thì cơ chất sẽ bị đổi màu. Nếu trong mẫu bệnh phẩm không có kháng nguyên thì phức hợp Kháng thể – Kháng nguyên – Kháng thể gắn enzym không đƣợc tạo thành, cơ chất không bị đổi màu.
b. Các bước tiến hành
* Chuẩn bị hóa chất và thiết bị
Bộ kit chẩn đoán virut Rota ProSpecT (Anh) gồm các thành phần:
Thành phần Thành phần chính
Phiến chuẩn độ 96 giếng Phủ kháng thể đa dòng thỏ đặc hiệu virut Rota nhóm A
Dung dịch pha loãng Đệm muối tris
Đối chứng dƣơng virut Rota bò bất hoạt
Cộng hợp Kháng thể đa dòng thỏ đặc hiệu virut Rota gắn với horseradish peroxidase
Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Phương Thuý
Cơ chất TMB Cơ chất chứa chỉ thị màu: 3,3‟ – 5,5‟- tetramethylbenzidine
Dung dịch dừng phản ứng H2SO4 0,46 mol/lit
Đệm rửa 10X Dung dịch đệm phosphat
Dụng cụ và nguyên vật liệu khác: chai đựng nƣớc, đệm, cồn, đồng hồ, giấy thấm…
Thiết bị: máy đọc đĩa 96 giếng (Microwell plate reader), hãng themrmo Labsystems (Nhật) có thể đọc đƣợc bƣớc sóng 450nm
* Các bước tiến hành:
Pha loãng mẫu 10% (100l mẫu + 900l dung dịch pha loãng)
Nhỏ 2 giọt (100l) mẫu đối chứng dƣơng vào giếng đã đánh dấu đối chứng dƣơng
Nhỏ 2 giọt (100l) mẫu đối chứng âm vào giếng đã đánh dấu đối chứng âm Nhỏ 2 giọt (100l) các mẫu đã pha loãng vào các giếng đã đánh dấu
Nhỏ 2 giọt (100l) cộng hợp enzym vào tất cả các giếng, vỗ nhẹ trên thành giếng để hỗn hợp trên đƣợc trộn lẫn, đậy nắp và phủ giấy bạc
Ủ ở nhiệt độ Phòng trong 60 ±5 phút
Đổ dịch trong giếng, úp ngƣợc và đập nhẹ phiến lên giấy thấm loại bỏ hết dịch, rửa 5 lần bằng đệm rửa
Nhỏ 2 giọt (100l) dung dịch chứa cơ chất vào từng giếng, ủ 10 phút ở nhiệt độ phòng
Nhỏ 2 giọt (100l) dung dịch dừng phản ứng vào từng giếng, lắc nhẹ phiến Quan sát bằng mắt thƣờng và đọc kết quả ở bƣớc sóng 450nm.
c. Đọc kết quả và kết luận
Đọc kết quả bằng mắt thƣờng: so sánh màu của mẫu với màu của chứng dƣơng và chứng âm.
Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Phương Thuý
Dương tính: có màu xanh Âm tính: không màu
Hình 8. Kết quả ELISA khi chƣa cho chất dừng phản ứng
Sau khi đã nhỏ dung dịch dừng phản ứng:
Dương tính: có màu vàng
Âm tính: không màu
Hình 9. Kết quả ELISA sau khi cho chất dừng phản ứng
Đọc kết quả trên máy ELISA: tại bƣớc sóng 450nm, giá trị hấp phụ hiển thị trên máy tính
Tính kết quả ngƣỡng dƣơng tính:
Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Phương Thuý
Kết luận:
Mẫu dƣơng tính: Khi có đơn vị hấp phụ lớn hơn hoặc bằng X
Mẫu âm tính: Khi có đơn vị hấp phụ nhỏ hơn X
Hình 10. Đọc kết quả mẫu bệnh phẩm trên máy ELISA
2.2.2.3 Phương pháp tách chiết ARN từ mẫu phân
a. Nguyên tắc
Mẫu đƣợc ly giải trong điều kiện biến tính cao để bất hoạt RNase và bảo vệ ARN nguyên vẹn. Sau đó sử dụng đệm tạo điều kiện thích hợp để ARN liên kết với màng QIAamp và các mẫu đƣợc gắn vào cột QIAamp mini.
ARN liên kết với màng và các tạp chất đƣợc loại đi bằng cách sử dụng 2 loại đệm rửa khác nhau. ARN tinh sạch sẽ đƣợc hòa tan trong đệm đặc biệt không chứa RNase. Các ARN tinh sạch không chứa protein, nuclease, các tạp chất và các chất ức chế khác.
b. Nguyên vật liệu và thiết bị
Kit tách chiết ARN: QIAamp Viral RNA mini Kit, hãng Qiagen, Mỹ Thành phần bộ kit gồm:
Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Phương Thuý
Tên hóa chất Thành phần chính Vai trò
Cột QIAamp mini
- Màng silicagel - Liên kết với ARN mẫu - Bền và không giữ lại Muối Đệm AVL - Guanidine
- Thiocyanate
- Ly giải, phá vỡ cấu trúc bậc 3 của protein, ADN/ARN và biến tính Đệm AW1 Đệm AW2 - Guanidine - hydrocloride - Loại bỏ tạp chất mà không ảnh hƣởng