Nguyên tắc: Việc phân tích trình tự ADN cho phép thực hiện một nghiên cứu tỉ mỉ về ADN, nó cung cấp thông tin cơ bản nhất đó là trật tự các nucleotit, giúp ta có thể tìm ra chức năng và trật tự gen, thực hiện những so sánh về các gen tương ứng giữa những loài khác nhau và phân loại các dạng đột biến. Dựa trên các đoạn mồi đặc hiệu để phân tích trình tự ADN của mẫu, cần xác định trực tiếp từ sản phẩm PCR.
Tiến hành: Tinh sạch sản phẩm PCR: Dùng Spinfilter unit (bộ kít làm siêu sạch sản phẩm PCR), lấy 20µl sản phẩm PCR cho vào Eppendorf, lọc qua spinfilter unit có bổ sung 50µl chất đệm spinbind sau đó loại bỏ dung dịch bằng siêu ly tâm tốc độ 13000rpm trong 30 giây. Spinfilter unit được rửa bằng 20µl chất đệm
spinclean, đem ly tâm 2 lần với tốc độ 13 000 vòng/phút trong 30 giây. Sau đó spinfilter unit được cài vào một Eppendorf mới. Cuối cùng, tách sản phẩm ADN ra khỏi spinfilter unit bằng siêu ly tâm tốc độ 13000rpm trong 60 giây cùng với 10µl chất đệm rửa trôi.
- Xác định nồng độ ADN: Sản phẩm ADN sau được đo bằng cappilary cell bước sóng 260nm và tính theo công thức: ADNABS 260 × 20 × 50ng/µl.
- Sử dụng kit BigDye Terminator để phân tích trình tự ADN trực tiếp từ sản phẩm PCR: lấy chừng 1µl sản phẩm sạch PCR (từ 30 hoặc 90ng) làm ADN khuôn và 3,2pmol/µl primer cho vào ống PCR tube (0.2ml, MicroAmp PCR), 2µl BigDye.
Tổng thể tích 20µl. Các mẫu được làm biến tính ở 96oC trong 3 giây rồi thực hiện
25 chu kỳ theo chu trình sau: 96oC trong 3 giây, 50oC trong 5 giây, 60oC trong 4
phút. Bước cuối cùng ở 4oC, thời gian bảo quản.
- Tủa sản phẩm ADN đã nhuộm và gắn với Big Dye: Bổ sung 2µl của 3M Na acetate (pH=4,5) và 500µl của ethanol.
23
Ly tâm tốc độ 15000 vòng/phút trong 30 phút. Sau đấy mẫu được rửa hai lần trong 500µl của 70% ethanol, loại bỏ etanol dùng ly tâm 15000 vòng/phút trong 5 phút. Làm khô mẫu bằng thiết bị khô chân không trong 5 phút.
Cuối cùng bổ sung 15µl Hi - Dye formamide cho việc tách rời các nucleotit và trộn nhẹ nhàng trong 1 phút, làm biến tính trong nước sôi 2 phút.
Làm lạnh ngay trong nước đá khoảng 5 phút. 10µl mẫu tra vào giếng của khay mẫu và được phân tích trong thiết bị đọc trình tự tự động ABI Prism 3100 Avant.