Chuẩn bị trang thiết bị và dự phòng sản xuất là một nguyên tắc cơ bản trong nuôi cấy vi tảo. Các bước phải được tiến hành một cách nghiêm ngặt, đặc biệt chú trọng vì đây chính là chìa khóa thành công cho một mẻ sản xuất.
1.Ngâm và rửa sạch thiết bị nuôi cấy bằng chất tẩy rửa. Làm sạch cặn bằng cách ngâm trong acid HCl (5-10%). Thu hồi acid HCl vào trong một chai thủy tinh và tái sử dụng lại.
2.Rửa sạch thiết bị nuôi cấy bằng nước ít nhất là năm lần, cho sạch hoàn toàn cặn.
3.Úp ngược các bình cho khô và tránh không khí sinh ra bụi bẩn bên trong bình.
4.Xịt ethanol (70-80%), rửa sạch bằng nước cất hoặc nước mưa lọc qua phin lọc 0,5 ~ 1μm, và úp ngược xuống cho khô.
5.Đậy nắp (màng nhôm) hoặc lưu trữ trong tủ bảo quản tránh tiếp xúc với bụi bẩn.
57
6.Rửa sạch lại bằng nước biển (nước biển đã được lọc qua phin lọc 0,2 ~ 0.5μm và tiệt trùng bằng đèn UV) trước khi sử dụng.
7.Cần đảm bảo tay sạch trước khi chạm vào bình và các thiết bị nuôi cấy sạch khác.
8.Rửa sạch tay bằng xà phòng và rửa sạch bất kỳ dư lượng hóa chất nào, sau
đó phun ethanol trước khi bắt đầu công việc.
9.Giữ sàn nhà và trang thiết bị trong phòng nuôi cấy sạch và khô, làm sạch sàn nhà với nước được khử trùng bằng clo.
10.Định kỳ kiểm tra và làm sạch bộ lọc không khí / đầu ra không khí của
máy điều hòa không khí.
58
59
3.6.2. Quy trình nuôi cấy vi tảo biển
Quy trình nuôi cấy vi tảo được thể hiện hình 3.23. Giống vi tảo thuần khiết
được lưu trữ, bảo quản tại phòng Sinh học Tảo, Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc Gia, Hà Nội và cung cấp giống cho hệ thống nuôi cấy.
3.6.2.1. Nhân nuôi giống gốc (nuôi cấy vô trùng, không cần sục khí)
Dung dịch giống vi tảo thuần khiết (20-100ml) từ phòng Sinh học Tảo, Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học được chuyển xuống trại giống. Nguồn giống này
được lưu giữ trong điều kiện nhiệt độổn định 20°C, chiếu sáng nhân tạo (đèn neon)
trong thời gian 3 ngày. Sau đó được sử dụng cho nhân nuôi giống gốc tại trại sản xuất giống trong các bình tam giác 100ml, 250ml hoặc 500ml. Các bình nuôi cấy và
môi trường được khử trùng ở 121°C trong 15 phút. Tuy nhiên nếu không có nồi khử
trùng chuyên dụng có thể sử dụng các thiết bị bếp gas hoặc điện để khử trùng, các bình chứa môi trường có nắp đậy bằng màng nhôm giữ trong nước nóng 70-80°C, thời gian 30 phút. Môi trường dinh dưỡng trong bình không nên đun sôi vì như thế
sẽ làm thay đổi giá trị dinh dưỡng của môi trường. Mục đích của khử trùng nhằm giảm thiểu nguy cơ nhiễm các mầm bệnh và các loài tảo khác trong bình trước khi bắt đầu nuôi cấy.
Cấy chuyển giống là cần thiết cho lưu giữ giống vi tảo trong thời gian dài, nhằm mục đích đáp ứng đủ về số lượng, thành phần và kịp thời giống cho quá trình sản xuất. Nhiễm khuẩn có thể xảy ra bất kể lúc nào trong quá trình nuôi cấy, gây
ảnh hưởng lớn đến các giai đoạn sản xuất tiếp theo. Vì vậy, việc cấy chuyển giống
nên được tiến hành trong tủ cấy vô trùng để giảm khả năng nhiễm khuẩn từ không khí. Rất ít các trại giống có tủ cấy nên có thể thay thế bằng cách thực hiện trong một buồng kín đơn với trần mở hoặc khoảng làm việc phân vùng với đèn cồn hoặc đèn
Bunsen (gas). Việc cấy chuyển phải được thực hiện cẩn thận, tránh tiếp xúc bề mặt khi cấy chuyển từ bình này sang bình khác. Giống nuôi cấy ở giai đoạn này có thể lưu giữ từ 7-14 ngày phụ thuộc vào nhiệt độ và nuôi cấy trong điều kiện ánh sáng yếu 500-1000 Lux. Tiến hành cấy chuyển 1- 10ml giống thuần khiết sang các bình tam giác 100-500 ml chứa môi trường dinh dưỡng. Giai đoạn này chủ yếu là nuôi cấy tĩnh không cần sục khí, lắc đều 2 lần mỗi ngày.
3.6.2.2 Nhân nuôi giống cấp 1 (nuôi cấy vô trùng, sục khí)
60
bình thể tích 2-5 lít để tạo giống cấp 1 (hình 3.24). Mục đích là giai đoạn nuôi cấy
này làm gia tăng mật độ tế bào vi tảo (trong khoảng 8-15 × 106tế bào/ml). Nuôi cấy
ở nhiệt độ 20-22°C, tăng cường chiếu sáng 4.000 Lux, sục khí liên tục và định kỳ
bổ sung khí CO2.
Hình 3.24. Nhân nuôi giống vi tảo cấp 1 trong bình tam giác và bình nhựa 2-5 lít
Sau 5-7 ngày nuôi cấy tiếp theo, tiến hành cấy chuyển 500ml giống ở giai
đoạn này sang các bình 2-5 lít chứa môi trường mới đây chính là giai đoạn trung
gian giúp tăng cường sinh khối các chủng giống trong pha sinh trưởng. Lượng giống còn lại ở mỗi bình tiếp tục được duy trì nuôi cấy trong 5-7 ngày sử dụng làm
61
nguồn giống cho nhân nuôi sinh khối ở quy mô lớn hơn.
3.6.2.3. Nhân nuôi sinh khối (không cần vô trùng, sục khí liên tục)
Khi giống cấp 1 đạt tới pha sinh trưởng với mật độ tế bào khoảng 6-10 × 106/ml, có thể vừa dùng làm giống cho cấy chuyển ở giai đoạn nhân nuôi giống cấp 1, lại là nguồn giống cho nhân nuôi sinh khối trong hệ thống túi plastic 30-60 lít (hình 3.25). San cấy 1-2 lít giống từ các bình giống cấp 1 sang túi plastic 30-60 lít. Nuôi cấy ở nhiệt độ 22-25°C, tăng cường chiếu sáng >4.000 Lux, sục khí liên tục và
định kỳ bổ sung khí CO2. Giai đoạn nuôi cấy này khi mật độ đạt lớn hơn 2 × 106tế
bào/ml, dùng làm thức ăn cho ấu trùng, con giống, con bố mẹ sinh sản hoặc cấy chuyển để tăng lượng giống cho nhân nuôi sinh khối ở quy mô lớn hơn từ 500-1000 lít.
Hình 3.25. Nhân nuôi sinh khối vi tảo trong túi plastic 30-60 lít
Chú ý giảm thiểu tối đa sự lây nhiễm trong nuôi cấy, tuy nhiên không tránh khỏi nhiễm khuẩn trong khi nuôi cấy. Cần để ý các hiện tượng sau: bọt xuất hiện trên bề mặt hoặc khối vi tảo và nước trở nên đục đây là các hiện tượng cho thấy nhân nuôi sinh khối vi tảo đã bị nhiễm nặng và lượng sinh khối này nên được loại
62
bỏ. Hệ thống thùng, bể nuôi cấy và các thiết bị sục khí được làm sạch bằng chlorine,
sau đó rửa kỹ lại bằng nước và cồn (75 - 85%). Nhân nuôi sinh khối trong thùng hoặc bể 500-1000 lít, các thùng hoặc bể này được làm sạch kỹ bằng nước ngọt sau khi rửa bằng chlorine.
3.6.3. Lựa chọn các loài vi tảo biển cho hệ thống nuôi
Vi tảo được sử dụng làm thức ăn cho nuôi trồng thủy sản nói chung và ngành
động vật thân mềm nói riêng phải đáp ứng đầy đủ dinh dưỡng cho sự phát triển của chúng. Nuôi cấy vi tảo làm thức ăn cho ấu trùng, con giống cũng như con bố mẹ
sinh sản trai ngọc là một yếu tố quan trọng nhất trong quá trình sản xuất giống trai ngọc. Rất nhiều loài vi tảo có thể được sử dụng làm thức ăn cho chúng nhưng
không phải loài nào cũng hỗ trợ sự tăng trưởng của loài động vật thân mềm đặc biệt này. Bởi sự khác nhau kích thước, khả năng tiêu hóa và đặc biệt là dinh dưỡng của vi tảo. Giá trị dinh dưỡng phụ thuộc chủ yếu vào thành phần sinh hóa của vi tảo và các giá trị dinh dưỡng cần thiết cho chăn nuôi sản xuất giống trai ngọc. Sáu loài vi tảo thường được sử dụng như làm thức ăn tươi sống cho ấu trùng, con giống và con bố mẹ sinh sản trai ngọc.
3.6.3.1. Chaetoceros calcitrans VĐ01
Theo Volkman Chaetoceros calcitrans và C. muelleri là các loài vi tảo có giá trị dinh dưỡng tốt và đã được sử dụng rộng rãi cho các trại sản xuất giống trai ngọc.
Chaetoceros calcitrans VĐ01 có chứa 12 loại acid béo không no đặc biệt chứa hàm
lượng cao AA và EPA. Mặc dù Chaetoceros calcitrans VĐ01 không có khả năng
chịu được nhiệt độ cao, sinh trưởng và phát triển trong khoảng nhiệt độ 25-28°C. Vi tảo này phù hợp khi kết hợp nuôi cấy với Isochrysis trong điều kiện nhiệt đới.
3.6.3.2. Chlorella vulgaris VĐ02
Mặc dù giá trị dinh dưỡng của vi tảo này là không cao như 5 loài vi tảo nghiên cứu. Tuy nhiên Chlorella vulgaris VĐ02 là một chủng vi tảo dễ thích nghi trong mọi điều kiện nhiệt độ có thể chịu được nhiệt độ lên tới 36°C, và độ mặn với dải tối ưu tương đối rộng 15-35‰.
3.6.3.3. Isochrysis galbana VĐ03
Isochrysis là một trong các loài vi tảo tốt nhất sử dụng cho nuôi trồng thủy sản ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Isochrysis galbana VĐ03 cho thấy sự
63
tăng trưởng nhanh chóng 3-5 × 106 tế bào/ml sau 3-5 ngày nuôi cấy ở giai đoạn nhân giống cấp 1 và tồn tại trong một khoảng thời gian dài mà vẫn duy trì mật độ
cao trong pha suy tàn (6-9 × 106 tế bào/ml trong 7 - 10 ngày) ở điều kiện chiếu sáng yếu, cho thấy loài này khả năng kháng chịu được sự nhiễm khuẩn. Loài này được coi là một loại thực phẩm thích hợp cho nuôi ấu trùng dài hạn. Vi tảo này có giá trị dinh dưỡng cao, đặc biệt chứa hai loại acid béo không bão hoà là EPA và DHA. Sự
kết hợp của Isochrysis và Chaetoceros spp. đã được sử dụng cho hoạt động sản xuất giống trai ngọc Úc.
3.6.3.4. Nannochloropsis oculata VĐ04
Vê mặt giá trị dinh dưỡng vi tảo Nannochloropsis oculata VĐ04 là loài đa
dạng nhất về thành phần acid béo trong 6 loài vi tảo nghiên cứu. Sau 4-6 ngày nuôi cấy mật độ tế bào có thể đạt tới 10-15 × 106/ml, tại pha suy tàn mật độ tế bào vẫn rất cao khoảng 8-12× 106/ml. Loài vi tảo này có thể chịu được nhiệt độ lên tới 38°C, tuy nhiên khả năng chịu mặn lại kém, nuôi cấy tốt nhất ở môi trường với độ mặn 20‰.
3.6.3.5. Navicula sp. VĐ05
Navicula gần đây đã được giới thiệu sử dụng trong sản xuất ấu trùng trai ngọc ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. bởi loài vi tảo silic này thích hợp cho sự
tạo vỏ của ấu trùng. Loài này có khả năng chịu nhiệt ở 32°C, độ mặn 30‰. Sự tăng trưởng ban đầu pha log của vi tảo này là rất chậm sau 5-7 ngày mật độ chỉ đạt 2-3 × 106 tế bào/ml. Nhưng sau đó tăng trưởng nhanh hơn với mật độ tế bào 5-7 × 106/ml.
3.6.3.6. Tetraselmis chuii VĐ06
Tetraselmis chuii VĐ06 chứa không nhiều loại acid béo, nhưng trong thành
phần lại chứa hai loại acid béo không bão hòa AA và DHA. Loài này có khả năng
thích nghi ở điều kiện nhiệt độ cao 38°C, độ mặn 35‰. Tuy giá trị sinh dưỡng không phải là quá cao nhưng loài vi tảo này thích hợp cho sự phát triển của ấu trùng trai ngọc ở giai đoạn sau từ 10 ngày tuổi, bởi kích thước lớn phù hợp với kích thước lỗ miệng của ấu trùng, ấu trùng dễ bắt và ăn vi tảo.
3.6.4. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy vi tảo
Môi trường F/2 Guillard là môi trường phổ biến nhất được sử dụng cho nuôi cấy vi tảo làm thức ăn cho ấu trùng động vật thân mềm hai mảnh vỏ. Môi trường
64
dinh dưỡng này chứa các thành phần cơ bản dễ dàng khi sử dụng. Có thể bảo quản ở
nhiệt độ phòng trong thời gian dài cho nuôi cấy vi tảo để tiết kiệm thời gian và đơn
giản hóa việc chuẩn bị. Tuy nhiên, tốt nhất nên được bảo quản trong lạnh ở 4°C. Trong nghiên cứu, sử dụng môi trường F/2 có thay đổi.
Bảng 3.6. Môi trường nuôi cấy F/2
Hàm lượng
Thành phần
Nhân giống gốc/Nhân giống cấp 1 Nhân nuôi sinh khối
NaNO3 85 mg/l 50 g/l Na2HPO4.12H2O 10 mg/l 5 g/l Na2SiO3.9H2O* 12 mg/l 6 g/l F/2 metal** 1 ml 100ml Vitamin B1 100 μg/l 10-50 mg/l Vitamin B12 0.5 μg/l 0.1-0.2 mg/l Biotin 0.5 μg/l 0.1-0.2 mg/l
*Na2SiO3.9H2O chỉ bổ sung cho môi trường nuôi cấy tảo silic ** 100 ml F/2 metal bao gồm: Na2EDTA.2H2O 440mg FeCl3.6H2O 316mg CoSO4.7H2O 1.2mg ZnSO4.7H2O 2.1mg MnCl2.4H2O 18mg CuSO4.5H2O 0.7mg Na2MoO4.2H2O 0.7mg
Bảng 3.7. Thành phần dung dịch của môi trường nuôi cấy
Dung dịch Nhân giống gốc
(ml) Nhân giống cấp 1 (l) Nhân nuôi sinh khối (l) 200ml môi trường 2.5 l môi trường 30 l môi trường
Dung dịch A (ml) 0.2 2.5 15
Dung dịch B (ml) 1.0 12.5 15
Dung dich C (ml) 0.2 2.5 15
Dung dich D (ml) 0.2 2.5 15
NaNO3 85g
Dung dịch A (Nguồn dinh dưỡng chính):
Na2HPO4.12H2O 10g 1.
65
Dung dịch B (F/2 Metals) Na2EDTA.2H2O 4.4g
FeCl3.6H2O 3.16g CoSO4.7H2O 0.012g ZnSO4.7H2O 0.021g MnCl2.4H2O 0.18mg CuSO4.5H2O 0.007g Na2MoO4.2H2O 0.007g 2.
Hòa tan trong 1 lít bằng nước cất. Giữ trong tủ lạnh.
Dung dịch C (Hỗn hợp Vitamin): Vitamin B1 100mg (lấy 10ml từ ốngdung dịch B1)
Vitamin B12 0.5mg
(lấy 0.5ml từ ống dung dịch B12)
Biotin 0.5mg
(lấy0.5ml từ ống dung dịch Biotin)
3.
Hòa tan trong 1 lít bằng nước cất. Giữ trong tủ lạnh.
Dung dịch D (Silicatedùng cho tảo
silic) Na2SiO3.9H2O 12g
4.
Hòa tan trong 1 lít bằng nước cất. Giữ trong tủ lạnh.
Bảng 3.8. Môi trường cho nhân nuôi sinh khối
Thể tích nuôi cấy (lít) Thành phần 100 200 500 1000 NaNO3 5g 10g 25g 50g Na2HPO4.12H2O 0.5g 1g 2.5g 5g F/2 Metals 10ml 20ml 50ml 100 ml Vitamin Mix 10ml 20ml 50ml 100ml Na2SiO3-9H2O* 0.6g 1.2g 3 g 6g
* Na2SiO3-9H2O chỉ bổ sung cho môi trường nuôi cấy tảo silic
3.6.5. Xác định mật độ tế bào vi tảo biển
Mật độ tế bào vi tảo là cần thiết bởi mật độ tế bào là thể hiện khả năng sinh trưởng và phát triển của vi tảo theo thời gian, giúp nhận định chính xác các pha sinh
trưởng của vi tảo thích hợp cho cấy san, cấy chuyển và dùng làm thức ăn khi nuôi
66 Cấu tạo buồng đếm Neubauer :
Buồng đếm Neubauer là một tấm thủy tinh dày khoảng 3 mm, được chia làm 2 phần. Các phần bên ngăn cách với phần giữa bởi 2 rãnh dọc. Phần giữa được chia
đôi do một rãnh ngang và thấp hơn hai phần bên 0.1 mm tạo ra hai ngăn đếm giống nhau. Mỗi ngăn đếm hình vuông, được chia thành 16 ô lớn và mỗi ô lớn lại được chia thành 16 ô nhỏ, mỗi một ô nhỏ có diện tích là 1/400 m2, và chiều cao là 1/10mm.
Số lượng tế bào được tính theo công thức:
D = ( a /64)× 106
Trong đó:
D: là số lượng tế bào (số tế bào /ml)
67
Thao tác đếm:
Buồng đếm và lamen được lau sạch bằng bông cồn, thấm khô trước khi cho mẫu tảo lam vào. Lamen được đặt trên buồng đếm, sao cho khi nhìn nghiêng thấy có sự giao thoa ánh sáng ở vị trí tiếp xúc giữa buồng đếm và lamen. Sau đó, dùng
pipete Pasteur hút một ít dịch chứa tảo lam đã được lắc đều trước chấm vào cạnh của lamen dịch tảo sẽ tràn láng vào buồng đếm .
Buồng đếm có chứa tảo lam được đưa lên kính hiển vi và quan sát ở vật kính 40 thị kính 10. Đối với những mẫu đếm quá đặc không thể chính xác được thì ta
68
KẾT LUẬN
1. Từ các mẫu nước được thu từ các đầm nuôi thủy sản và vùng biển tại Vân
Đồn, Quảng Ninh đã phân lập được 6 chủng vi tảo biển. Dựa vào đặc điểm hình thái và phân tích giải trình tự rADN 18s sáu chủng vi tảo biển được
định danh thuộc các loài:
Chủng VĐ01 thuộc loài Chaetoceros calcitrans
Chủng VĐ02 thuộc loài Chlorella vulgaris
Chủng VĐ03 thuộc loài Isochrysis galbana
Chủng VĐ04 thuộc loài Nannochloropsis oculata
Chủng VĐ05 thuộc loài Navicula sp.
Chủng VĐ06 thuộc loài Tetraselmis chuii
1. Sáu chủng vi tảo đều có hàm lượng acid béo omega3 và omega6 cao lần lượt từ 1.018-24.975% và 0.285-11.67%. Đặc biệt là chủng Chaetoceros calcitrans VĐ01 hàm lượng omega3 và omega6 đạt cao nhất đạt 24.975 và 11.67% tổng hàm lượng acid béo.
2. Ấu trùng trai ngọc 2, 4, 5, 10 và 22 ngày tuổi ăn được các loài vi tảo biển