Nhân đoạn gen bằng phản ứng PCR

a. Chuẩn bị mẫu cho phản ứng PCR

Trình tự mồi:

ITS1 F : 5’ – TCCGTAGGTGAACCTGCGG – 3’ ITS4 R : 5’ – TCCTCCGCTTATTGTATGC – 3’

dNTP (2,5mM) 2l Mồi 0,5l (10pmol cho mỗi loại mồi-ngược và xuôi)

21

Mẫu (50 - 90ng) 2l Taq polymeraza 0,3l (Taq 5U/ml) Tổng cộng thể tích phản ứng 20 l

b. Chương trình chạy PCR

Biến tính ADN ở 94⁰C trong 3 phút.

Chạy nhắc lại 30 chu kỳ tại: 94⁰C trong 30 giây. 48⁰C trong 30 giây. 72⁰C trong 1 phút 20 giây. Hết một chu kỳ.

Tổng hợp : 72⁰C trong 10 phút.

Kết thúc chương trình ở 4⁰C nhiệt độ bảo quản.

Kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di trên gel agaroza

Pha đệm : Chúng tôi tiến hành pha dung dịch đệm 10  TAE Tris 242g Acid axetic 57,1ml 0.5M Na₂EDTA pH=8.0 100ml

Thêm Milli-Q pha thành một lít

Trong quá trình chạy điện di dùng dung dịch đệm 1  TAE (của 10  TAE pha loãng dịch 10 lần trong 100ml Milli-Q).

c. Đổ gel

Cân 0,8 - 1,2g agaroza cho vào 100ml dung dịch đệm 1  TAE,

đun sôi cho đến khi agaroza tan hết. Lắc đều để nguội đến 40 - 50⁰C. Đổ gel vào khay đã cài sẵn lược.

Để 30 phút cho tới khi bản gel cứng, rút lược và đặt khay gel vào máy điện di.

d. Tra mẫu

- Tra 1µl của 1 kb ADN ladder (Takara) trộn với 2µl của 6 × loading buffer dùng

như ADN chuẩn.

- Tra mẫu vào từng giếng.

e. Chạy điện di:

Với dòng điện 100V trong thời gian 20-30 phút cho tới khi vạch màu đến 2/3 bản gel.

22

f. Soi bản gel trên máy soi UV của Bio-rad

Kết quả ADN mới được nhân lên trong phản ứng PCR sẽ hiện hình dưới những vạch đỏ màu da cam.