a. Chuẩn bị mẫu cho phản ứng PCR
Trình tự mồi:
ITS1 F : 5’ – TCCGTAGGTGAACCTGCGG – 3’ ITS4 R : 5’ – TCCTCCGCTTATTGTATGC – 3’
dNTP (2,5mM) 2l Mồi 0,5l (10pmol cho mỗi loại mồi-ngược và xuôi)
21
Mẫu (50 - 90ng) 2l Taq polymeraza 0,3l (Taq 5U/ml) Tổng cộng thể tích phản ứng 20 l
b. Chương trình chạy PCR
Biến tính ADN ở 940C trong 3 phút.
Chạy nhắc lại 30 chu kỳ tại: 940C trong 30 giây. 480C trong 30 giây. 720C trong 1 phút 20 giây. Hết một chu kỳ.
Tổng hợp : 720C trong 10 phút.
Kết thúc chương trình ở 40C nhiệt độ bảo quản.
Kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di trên gel agaroza
Pha đệm : Chúng tôi tiến hành pha dung dịch đệm 10 TAE Tris 242g Acid axetic 57,1ml 0.5M Na2EDTA pH=8.0 100ml
Thêm Milli-Q pha thành một lít
Trong quá trình chạy điện di dùng dung dịch đệm 1 TAE (của 10 TAE pha loãng dịch 10 lần trong 100ml Milli-Q).
c. Đổ gel
Cân 0,8 - 1,2g agaroza cho vào 100ml dung dịch đệm 1 TAE,
đun sôi cho đến khi agaroza tan hết. Lắc đều để nguội đến 40 - 500C. Đổ gel vào khay đã cài sẵn lược.
Để 30 phút cho tới khi bản gel cứng, rút lược và đặt khay gel vào máy điện di.
d. Tra mẫu
- Tra 1µl của 1 kb ADN ladder (Takara) trộn với 2µl của 6 × loading buffer dùng
như ADN chuẩn.
- Tra mẫu vào từng giếng.
e. Chạy điện di:
Với dòng điện 100V trong thời gian 20-30 phút cho tới khi vạch màu đến 2/3 bản gel.
22
f. Soi bản gel trên máy soi UV của Bio-rad
Kết quả ADN mới được nhân lên trong phản ứng PCR sẽ hiện hình dưới những vạch đỏ màu da cam.