ADN được tách chiết từ sinh khối ướt theo phương pháp của Fawleys . Lấy vào khoảng 2 - 5 mg sinh khối tế bào sau 5 ngày nuôi cấy, ly tâm lạnh ở 4ºC với tốc
độ 8000 - 9000 vòng trong 15 phút và rửa 2 lần bằng 300 l dung dịch muối EDTA pH 8.0 (0.5M Na2EDTA, 0.15M NaCl). Sau đó tạo dịch huyền phù trở lại trong 300l đệm 10l TE (10mM Tris - HCl, 1mM EDTA, PH 8.0, tỷ lệ mẫu : đệm, 1:2).
Sau đó bổ sung tiếp 500l dịch phá tế bào (Triston- X100 2% (v/v), 1% SDS, 100 mM NaCl, 1mM EDTA 8.0, 10 mM Tris 8.0), và hạt thuỷ tinh (tỉ lệ 1:2 mg/v), trộn
20
thể tích bằng 1/3 thể tích mẫu, trộn đều trong 5-10 phút bằng tay. Cuối cùng bổ sung protein K (Sigma, 20mg/ml proteinase K trong 1/10l TE), ủ mẫu ở 56ºC trong 10 - 15 phút. Sự tan tế bào được xác định bằng sự trong suốt của dung dịch cùng với sự tăng độ nhớt tương ứng, rồi làm lạnh trong nước đá 10 phút. Tiếp theo, ly tâm mẫu
ở 15000 vòng/phút thời gian 15 - 20 phút để phân lớp. Sau đó chuyển phần nhớt ở pha đầu sang Eppendof (Cỡ 1,5ml) mới và ADN được tách ra bằng bổ sung ethanol lạnh (ethanol 95,5% giữ ở 22ºC) với thể tích gấp đôi thể tích mẫu và 2l của 3M Na-acetate (pH=4,5). Ngâm ADN trong 100l ethanol 70% trong 30 phút và sau đó
ngâm liên tiếp trong ethanol 80%, 90%, 95% cho mỗi nồng độ trong 5 phút. Sợi ADN làm khô bằng nhiệt độ phòng trong 10 phút và được làm tan trở lại trong 50 l
đệm 0.1l TE (của 10l TE) ở 4ºC qua đêm.
Dịch đem phân tích bằng máy quang phổ kế ở các bước sóng 230, 260 và 280 nm. ADN hấp thụ rất nhanh ở bước sóng 260nm, ở bước sóng 280 chứng tỏ có mặt của protein. Bước sóng 230 nm biểu hiện sự có mặt của chất đệm, các muối
như EDTA và của arn. Các tỷ lệ chuẩn về hấp thụ của ADN ở các bước sóng 230 :
260 : 280 là 1.0 : 1.8 : 1. Hàm lượng ADN được tính như sau: 1 đơn vị OD (mật độ
quang, Optical Durity) ở 260nm tương đương với 50l/mg ADN.
Cách tính: Đơn vị mẫu độ loãng chỉ số/1000 = ADNg/l.
Nếu ADN chưa sạch cần khử protein và ARN bằng enzym proteaza K và RnazaA