3.3.1. Lựa chọn điều kiện chiết rút γ-decalactone
3.3.1.1. Lựa chọn dung môi chiết rút
Các dung môi hữu cơ không phân cực (diethyl ether, n-hexane) và dung môi hữu cơ phân cực (ethyl acetate) đã được sử dụng để chiết rút γ-decalactone tạo thành trong môi trường lên men bằng chủng Y. lipolytica VTP5. Kết quả trình bày trong bảng 3.10 cho thấy: Diethyl ether là dung môi tốt nhất. Nếu coi hiệu suất tách chiết γ-decalactone của diethyl ether là 100% thì hiệu suất tách chiết γ-decalactone của n-hexane và ethyl actetate tương ứng là 50,9 và 53,2%.
Bảng 3.10. Lựa chọn dung môi tách chiết -decalactone từ dịch lên men
Dung môi tách chiết Lƣợng γ- decalactone (g/L)
Hiệu suất tách chiết (%)
Diethyl ether 1,917 ± 0,034 100
Ethyl acetate 1,020 ± 0,026 53,2
n-hexane 0,975 ± 0,012 50,9
Có thể vì hiệu suất tách chiết cao hơn hẳn của diethyl ether so với hai dung môi kia mà đa số các tác giả đều sử dụng diethyl ether để tách chiết các lactone tích tụ trong môi trường chuyển hóa sinh học [6][22][24]. Tuy nhiên cũng có một số tác giả sử dụng n-hexane [3][15][17], hoặc ethyl acetate để tách chiết γ-decalactone từ dịch lên men các chủng nấm men khác nhau [13].
Tuy nhiên, việc sử dụng diethyl ether cũng có nhược điểm: ở tất cả các phổ sắc ký khí đều nhận thấy ngoài γ-decalactone còn có tạp chất. Điều này có thể là do diethyl ether không những chiết rút được -decalactone mà cả các hợp phần khác của dầu thầu dầu và của sinh khối nấm men trong dịch lên men. Vì vậy, để thu nhận
-decalactone tinh khiết, cần phải có phương pháp làm sạch thích hợp, hoặc sử dụng các phương pháp thu nhận khác như hấp phụ -decalactone trên các vật liệu kỵ nước, hoặc chưng chất, thu dịch ngưng tụ chứa chất thơm và sau đó mới chiết rút bằng dung môi để loại bỏ/hạn chế tạp chất trong sản phẩm [8][34].
3.3.1.2. Lựa chọn điều kiện lactone hóa
Nhiều tác giả đã thực hiện lactone hóa dịch lên men để thu nhận - decalactone ở các điều kiện như: axít hóa dịch lên men đến pH 1,5 – 2 có gia nhiệt (80-120oC trong 10-30 phút) [15][17][34], hoặc axít hóa ở nhiệt độ phòng [13][41]. Trong nghiên cứu của mình, chúng tôi so sánh hiệu suất chiết rút -decalactone bằng diethyl ether khi sử dụng hai phương pháp lactone hóa có gia nhiệt và lactone hóa không gia nhiệt. Kết quả được trình bày trong bảng 3.11.
Bảng 3.11. Lựa chọn điều kiện lactone hóa để thu nhận γ-decalactone từ dịch lên men
Phƣơng pháp lactone hóa
Điều kiện lactone hóa Lƣợng γ- decalactone (g/l)
Lactone hóa không gia nhiệt
Dịch lên men không axit hóa (pH khi kết thúc lên men = 4,12) 1,252 ± 0,018 Axit hóa pH đến 2 2,037 ± 0,034 Axit hóa pH đến 1,5 1,827 ± 0,031 Lactone hóa có gia nhiệt
Axít hóa pH đến 2; đun nóng 85oC/10 phút 1,651 ± 0,037 Axít hóa pH đến 2; đun nóng 85oC/20 phút 1,611 ± 0,023 Axít hóa pH đến 2; đun nóng 85oC/30 phút 1,836 ± 0,039
Axít hóa pH đến 2; đun nóng 90oC/10 phút 1,899 ± 0,023
Axít hóa pH đến 2; đun nóng 90oC/20 phút 1,906 ± 0,021
Axít hóa pH đến 2; đun nóng 90oC/30 phút 1,921 ± 0,033
Qua bảng 3.11 có thể thấy:
- pH môi trường khi kết thúc lên men có giá trị = 4,12. Trong điều kiện không gia nhiệt và không axít hóa, thì lượng -decalactone được chiết rút là thấp (1,252 g/L).
- Cũng trong điều kiện không gia nhiệt, việc axít hóa dịch lên men đến pH = 1,5 hoặc 2 đã làm tăng hiệu suất chiết rút so với trường hợp không axít hóa, (1,827 và 2,037 g/L, theo thứ tự, so với 1,252 g/L).
- Việc gia nhiệt dịch lên men ở 90oC trong thời gian 20-30 phút sau khi axít hóa đến pH 2 có hiệu quả chiết rút xấp xỉ với phương pháp không gia nhiệt (1,906 và 1,921 g/L so với 2,037 g/L).
Tuy nhiên, ở các mẫu lactone hóa có gia nhiệt, phổ sắc ký đồ có ít các đỉnh tạp hơn so với các mẫu lactone hóa không gia nhiệt. Điều đó có thể là do trong quá trình gia nhiệt đã loại trừ được một số chất bay hơi.
3.3.1.3. Lựa chọn tốc độ khuấy và thời gian chiết rút γ-decalactone
Bảng 3.12 cho thấy kết quả của thí nghiệm này như sau:
- Tốc độ khuấy thích hợp để chiết rút -decalactone từ dịch lên men bằng dung môi diethyl ether là 100 vòng/phút. Nếu tăng tốc độ khuấy đến 150 – 200 vòng/phút thì lượng -decalactone được tách chiết giảm dần. Do vậy chúng tôi dùng tốc độ khuấy 100 vòng/phút để nghiên cứu lựa chọn thời gian chiết rút thích hợp.
- Thời gian chiết rút từ 10 đến 25 phút không ảnh hưởng nhiều đến hiệu suất chiết rút -decalactone như trường hợp của tốc độ khuấy. Tuy nhiên, do diethyl ether có nhiệt độ bay hơi thấp (35oC) nên nếu kéo dài thời gian chiết rút thì dung môi sẽ bị hao hụt, ảnh hưởng đến hiệu suất thu nhận -decalactone và dung môi. Vì thế theo chúng tôi, thời gian chiết rút tốt nhất là từ 10 đến 15 phút.
Bảng 3.12. Ảnh hưởng của tốc độ khuấy và thời gian chiết rút đến hiệu suất thu
nhận γ-decalactone từ dịch lên men
Chỉ tiêu Thông số Lƣợng γ-decalactone (g/L)
Tốc độ khuấy
(Thời gian chiết rút 5 phút)
50 vòng/phút 1,545 ± 0,36
100 vòng/phút 1,774 ± 0,022
150 vòng/phút 1,530 ± 0,014 200 vòng/phút 1,305 ± 0,018 Thời gian chiết rút
(Khuấy 100 vòng/phút) 5 phút 1,774± 0,037 10 phút 2,243 ± 0,034 15 phút 2,258 ± 0,027 20 phút 2,099 ± 0,039 25 phút 2,022 ± 0,045
3.3.1.4. Lựa chọn tỷ lệ dung môi chiết rút
Kết quả được trình bày trong bảng 3.13 cho thấy tỷ lệ dung môi/dịch lên men (v/v) thích hợp để chiết rút γ-decalactone là 0,5/1. Khi tăng tỷ lệ dung môi, tổng lượng γ-decalactone được chiết rút từ dịch lên men có tăng lên, nhưng lượng dung môi tiêu tốn cũng tăng theo. Nếu coi hiệu suất chiết rút theo tỷ lệ dung môi tương đương với thể tích dịch lên men (tỷ lệ 1/1) là 100% thì khi chiết rút một nửa thể tích dung môi (tỷ lệ 0,5/1), hiệu suất thu nhận γ-decalactone là 97,2%.
Bảng 3.13. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi sử dụng đến hiệu suất chiết rút γ- decalactone từ dịch lên men
Tỷ lệ dung môi/dịch lên men
(v/v) Lƣợng dung môi chiết rút thu đƣợc (mL) Lƣợng γ- decalactone (mg/mL) Tổng lƣợng γ- decalactone (mg) Hiệu suất thu nhận(%) 0,3/1 27 5,392 145,6 ± 0,022 92,0 0,5/1 45 3,417 153,8 ± 0,027 97,2 0,7/1 65 2,386 155,1 ± 0,034 98,0 1/1 94 1,684 158,3 ± 0,021 100 3.3.1.5 Lựa chọn số lần chiết rút
γ-decalactone trong dịch lên men được chiết rút 3 lần bằng diethyl ether với tỷ lệ dung môi/dịch lên men tương ứng là 0,5/1, 0,3/1 và 0,3/1, phần dung môi sau mỗi lần chiết rút được phân tích GC để xác định lượng γ-decalactone trong đó. Kết quả được trình bày trong bảng 3.14 cho thấy chỉ cần chiết rút 1 lần đã thu nhận được 96,5% γ-decalactone trong dịch lên men, còn lại 3,5% được chiết rút nốt trong lần thứ 2.
Như vậy, khi sử dụng dung môi diethyl ether, với tốc độ khuấy 100 v/p, thời gian chiết rút 10 phút, chỉ cần chiết rút 1 lần để thu nhận γ-decalactone từ dịch lên men.
Bảng 3.14. Ảnh hưởng của số lần chiết rút đến hiệu suất chiết rút γ-decalactone từ
dịch lên men
Số lần chiết rút Lƣợng γ-decalactone (g/L) Hiệu suất thu nhận (%)
Lần 1: tỷ lệ diethyl ether/dịch lên men = 0,5/1 (v/v)
3,417 ± 0,019 96,5
Lần 2 (tỷ lệ 0,3/1) 0,124 ± 0,011 3,5
Lần 3 (tỷ lệ 0,3/1) 0 0
3.3.2.Lựa chọn điều kiện thu nhận và làm sạch γ-decalactone từ dịch lên men
Thu nhận sản phẩm là một bước quan trọng và khó khăn nhất trong nhiều quá trình sản xuất các sản phẩm công nghệ sinh học, đặc biệt đối với các chất tạo hương thơm, vì tính chất dễ bay hơi và kém hòa tan của chúng. Các phương pháp đã được sử dụng trong công nghệ để chiết rút và thu nhận các chất thơm từ môi trường lỏng bao gồm: dùng dung môi hữu cơ, chưng cất, phân tách trên các loại màng chuyên dụng, hấp phụ trên cacbon hoạt tính [28][37][38] hoặc sử dụng các loại nhựa hữu cơ lỗ xốp để chiết rút các chất hương thơm, do tính chất kị nước tự nhiên và diện tích bề mặt lớn của chúng [8].
Do điều kiện thực tế tại nơi thực tập, sau khi nghiên cứu lựa chọn điều kiện lactone hóa và chiết rút γ-decalactone từ dịch lên men, chúng tôi đã tiến hành khảo sát điều kiện thu nhận và làm sạch γ-decalactone theo hai phương pháp: (i) “chiết rút - làm sạch”, và (ii) “ chưng cất - chiết rút - làm sạch”. Sự khác nhau cơ bản giữa 2 phương pháp này là ở chỗ: theo phương pháp thứ hai, việc chưng cất đã loại bỏ được một số hợp phần khó/ không bay hơi trong dịch sau lên men, mà phương pháp thứ nhất không thể. Trong các loại thực nghiệm này, các mẫu nghiên cứu được thực hiện với lượng mẫu 1000 mL dịch lên men/lần.
3.3.2.1. Thu nhận và làm sạch γ-decalactone theo phương pháp “chiết rút – làm sạch”
Bảng 3.15 trình bày hiệu suất thu nhận γ-decalactone từ dịch lên men sau mỗi công đoạn chiết rút, làm sạch và thu nhận. Kết quả thu được cho thấy:
- Hiệu suất thu nhận γ-decalactone theo phương pháp này, sau khi qua tất cả các công đoạn, đạt 50,1%. γ-decalactone thu được theo cách như vậy có độ sạch sắc ký là 99,43% (hình 3.5 B).
- Hiệu suất thu nhận γ-decalactone trong phần nước sau khi rửa kiềm lần 1 và lần 2 là rất thấp, (2,4 và 2,9% theo thứ tự). Vì vậy, khi thực hiện chiết rút và thu nhận γ-decalactone từ dịch lên men ở quy mô lớn, không cần bước thu nhận γ- decalactone ở pha nước sau khi rửa kiềm.
Bảng 3.15. Hiệu suất thu nhận γ-decalactone từ dịch lên men theo phương pháp “chiết rút - làm sạch” Tên mẫu Lƣợng dung môi chiết thu đƣợc (mL) Lƣợng γ- decalactone (mg/mL) Tổng Lƣợng γ-decalactone (mg) Hiệu suất thu nhận (%)
1000 mL dịch lên men, axit hóa đến pH = 2, chiết rút bằng
diethyl ether (tỷ lệ dung môi/dịch lên men =0,5/1), thu pha dung môi
445 4,526 2014,1 ± 0,41 100
Rửa kiềm lần 1 (NaOH 0,1N, pH=12, tỷ lệ 1: 1).
- Thu phần dung môi (a) 410 3,645 1494,5 ± 0.35 74,2 - Phần nước chứa cặn,chỉnh pH
đến 2, chiết rút bằng DE (0,5/1), thu phần dung môi
210 0,230 48,3 ± 0.16 2,4 Rửa kiềm lần 2 đối với phần
dung môi (a) (NaOH 0,1N, pH=12, tỷ lệ 1:1).
- Thu phần dung môi (b) 370 3,691 1365,7 ± 0,47 67,8 - Pha nước chứa cặn, chỉnh pH
đến 2, chiết rút bằng DE (0,5/1), thu phần dung môi
195 0,299 58,3 ± 0,22 2,9 Phần dung môi (b) được cô chân
không để đuổi DE ở 35oC. Bổ sung ethanol (99,5%) và cô chân không, để đuổi hết DE ở nhiệt độ 55oC. Thu dịch γ-decalactone cô đặc
3.3.2.2. Thu nhận γ-decalactone theo phương pháp “Chưng cất - chiết rút - làm sạch”
Theo phương thức này, dịch lên men, sau khi được axit hóa đến pH = 2, được chưng cất trong thiết bị chưng cất cồn, quy mô phòng thí nghiệm, và thiết bị chưng cất cuốn hơi nước Clevenger. Kết quả được trình bày trong bảng 3.16 cho thấy hiệu suất thu nhận γ-decalactone theo phương pháp “Chưng cất – chiết rút” là rất thấp, chỉ đạt 35,4 %, với độ sạch sắc ký là 99,43%. (Hình 3.5 C).
Bảng 3.16. Hiệu suất thu nhận γ-decalactone từ dịch lên men theo phương pháp
“chưng cất- chiết rút” Tên mẫu Lƣợng dung môi chiết thu đƣợc (mL) Lƣợng γ- decalactone (mg/mL) Tổng lƣợng γ- decalactone (mg) Hiệu suất thu nhận (%)
Dịch lên men được chiết rút bằng diethyl ether sau khi axit hóa đến pH=2
4,166 4166,0 ± 0,39 100
Sử dụng thiết bị chưng cất cồn
1000 mL dịch lên men pH=2, chưng cất ở 100oC; Thu 800 ml dịch ngưng tụ, chiết rút bằng DE (0,5/1). Thu pha dung môi chiết
400 7,894 3157,6 ± 0,31 75,8
Cô chân không đuổi dung môi DE ở nhiệt độ 35oC (760 mmHg); bổ sung ethanol (99,5%) và cô chân không đuổi hết dung môi DE ở nhiệt độ 55oC (350 mmHg)
6,0 204,322 1225,9 ± 0,45 29,4
Chưng cất bằng thiết bị Clevenger
1000 mL dịch lên men, pH=2, chưng cất ở 100oC, thu nhận:
- γ-decalactone không tan trong nước
4,0 203,16 812,6 ± 0,34 - 800 ml dịch ngưng tụ, chiết rút
bằng DE (0,5/1). Thu pha dung môi chiết. Cô chân không đuổi dung môi DE ở 35oC (760 mmHg); bổ sung ethanol (99,5%) và cô chân không đuổi hết dung môi DE ở 55oC (350 mmHg)
4,0 165,633 662,5 ± 0,29
Tổng 1475,1 35,4
Hiệu suất thu nhận γ-decalactone từ dịch lên men trong các nghiên cứu của chúng tôi, ở cả 2 phương pháp thấp hơn so với của Alchihab và cộng sự (2010): Khi sử dụng nhựa MN-202 để hấp phụ γ-decalactone từ dịch lên men trên thiết bị dung tích 100 lít bằng chủng nấm men ưa lạnh Rh. aurantiaca A19 và sau đó phản hấp phụ bằng ethanol, hiệu suất thu nhận γ-decalactone sau khi cô kiệt đuổi dung môi đạt 56% [8].
(A)
(C)
(D)
Hình 3.5. Sắc ký đồ γ-decalactone thu nhận từ dịch lên men bằng chủng Y.
lipolytica VTP 5 (A), sau khi làm sạch bằng phương pháp “Chiết rút-làm sạch”
(B), bằng phương pháp “Chưng cất-chiết rút-làm sạch” (C), γ-decalactone cô đặc (D).
KẾT LUẬN
1. Các điều kiện lên men thích hợp để chuyển hóa dầu thầu dầu thành γ- decalactone nhờ chủng nấm men Y. lipolytica VTP5 là như sau:
a) Trên máy lắc, giá trị pH là 6,0; tốc độ lắc 200 v/p; tuổi giống 9 giờ và tỉ lệ giống 10% (v/v, mật độ giống = 6.5x106 tế bào/mL); và thời gian thích hợp là 4 ngày.
b) Trên nồi lên men 5L, so sánh lên men theo mẻ và theo mẻ có tiếp dần cơ chất, (khống chế pH, DO) thì phương thức thứ hai cho lượng γ- decalactone cao nhất, đạt 7,343 g/L.
c) Trên nồi lên men 50L, lên men theo mẻ có tiếp dần cơ chất, không khống chế pH và DO, lượng γ-decalactone đạt 8,10 g/L.
d) So sánh ba quy mô lên men cho thấy năng xuất thu nhận γ-decalactone là như sau:
50L > 5L, và 5L > trên máy lắc.
2. Các điều kiện thích hợp để thu nhận sản phẩm từ dịch lên men bằng chủng
Y. lipolytica VTP5 là như sau:
- Dung môi diethyl ether, lactone hóa tại pH 2 có gia nhiệt 90oC/10 phút. - Tốc độ chiết rút 100 v/p.
- Tỉ lệ dung môi/ dịch lên men là 0,5/1, số lần chiết rút là 1.
3. So sánh hai phương pháp thu nhận γ-decalactone (“chiết rút – làm sạch” và “chưng cất - chiết rút” ) cho thấy:
- Hiệu suất thu nhận ở cả hai phương pháp đều thấp (29,4% và 35,4%) nhưng chất thơm thu được đều có độ tinh sạch cao (99,43%).
KIẾN NGHỊ
1. Về quá trình lên men
- Tiếp tục lên men chuyển hóa dầu thầu dầu thành γ-decalactone bằng chủng Y.
lipolytica VTP 5 trên nồi lên men 50L hoặc lớn hơn mà có khả năng khống chế
được pH và DO. 2. Về dung môi
- Cần nghiên cứu thêm dung môi có khả năng chiết rút được nhiều lượng - decalactonehơn dung môi đã dùng.
- Cần nghiên cứu thêm phương pháp thu nhận sản phẩm bằng cách chiết nhờ hai hay nhiều nhóm dung môi khác nhau.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Lại Thị Ngọc Hà (2003), “ Một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp γ-decalactone của chủng nấm men Yarrowica lipolytica W29”, Tạp chí khoa học kỹ
thuật Nông nghiệp, tr. 222 – 226.
2. Đặng Thị Thu, Cơ sở công nghệ sinh học tập 2, Công nghệ hóa sinh, Nhà xuất bản Giáo dục Việt Nam.
3. Vũ Nguyên Thành (2003), Báo cáo tổng kết nhiệm vụ thường xuyên “ Bảo tồn, lưu giữ nguồn gen vi sinh vật công nghiệp thực phẩm 2003”, Viện Công nghiệp Thực phẩm.
4.Bùi Quang Thuật và Kula J ( 2006), “ Tổng hợp các hợp chất thơm và chất hoạt động sinh học từ dầu thầu dầu”, Tuyển tập các công trình nghiên cứu ứng dụng
công nghệ sinh học – công nghiệp thực phẩm giai đoạn 2001 – 2005, Nhà xuất bản
Lao động xã hội, tr. 377 – 383.