Dịch chiết cô đặc chứa (γ-decalactone) được làm sạch bằng cách rửa bằng
kiềm (NaOH pH 11-12), sau đó chiết lại bằng diethyl ether, rồi loại bỏ dung môi bằng thiết bị cô quay chân không, đến khi dung môi bay hơi hết. Dịch thu được sau thủ tục này được gọi là dịch chiết sạch 1 (rửa bằng kiềm) sẽ được định lượng γ- decalactone bằng GC hoặc dùng cho thủ tục cuối cùng: đánh giá cảm quan.
2.2.11.2 Làm sạch dịch chiết cô đặc bằng Na2SO4 khan
Dịch sau cô đặc được pha vào cồn tuyệt đối (tỷ lệ 20 ml dịch cồn/50 ml dịch cô đặc) rồi loại bỏ dung môi nhờ thiết bị cô quay chân không tới khi cồn và diethyl ether còn sót lại bay hơi hết, dịch thu được tiếp tục được làm sạch bằng Na2SO4
khan. Dịch thu được sau thủ tục này được gọi là dịch chiết sạch 2 (bằng Na2SO4).
2.2.12. Đánh giá cảm quan
Đánh giá sự sinh trưởng nấm men thông qua khối lượng sinh khối.
Đánh giá màu sắc dịch sau lên men thông qua sự đồng đều của màu sắc trong các bình sau lên men.
2.2.13. Phân tích định lƣợng -decalactone bằng sắc ký khí
Sử dụng phương pháp sắc ký khí (Gas Chromatography-GC) được thực hiện tại Trung tâm phân tích, Viện Khoa học hình sự, Bộ Công An
Nguyên lý: Mẫu được phân tích GC bơm vào trong cột và theo dòng khí
mang (thường là nitơ) đưa đến cột sắc ký (pha tĩnh). Mẫu khi qua cột này sẽ được hấp phụ lên trên pha tĩnh đó. Sau đó, các chất lần lượt tách khỏi cột theo dòng khí ra và được ghi nhận bởi đầu dò. Từ các tín hiệu nhận được, máy tính sẽ xử lý và biểu hiện kết quả bằng sắc ký đồ. Hàm lượng mỗi chất được xác định nhờ thời lượng lưu trên sắc ký đồ.
Thực hiện:
Dùng pipet sạch hút chính xác 100 μl mẫu phân tích GC sau đó bổ xung dung dịch chuẩn: γ-decalactone (mg/mL), cho vào ống Eppendort sạch đã thanh trùng có đánh số kí hiệu mẫu phân tích GC.
Thông số thiết bị sắc kí:
+ Thiết bị GC Aligent 6890 A/ USA + Thể tích mẫu tiêm: 2 μl
+ Khí mang: N2
+ Detector ion hóa ngọn lửa (FID), khí đốt của FID: H2 + O2
+ Cột HP1: 30μm, nhiệt độ từ 80OC- 250OCtrong 10 phút, kích thước cột 30μm x 250μm x 0.25 μm.
Sơ đồ quá trình lên men thu nhận -decalactone: Chủng nấm men nghiên cứu Hoạt hóa Dịch môi trường YM chứa nấm men Nhân giống Dịch môi trường nhân giống chứa nấm men
Lên men Huyền dịch sau lên
men
Dịch sau lên men (đã loại sinh khối)
Ly tâm (10000 v/p) loại sinh khối
Dịch lactone hóa Lactone hóa bằng HCl pH 1,5-2 Chiết bằng dung môi Dịch chiết (chứa γ- decalactone) Dịch chiết cô đặc (chứa
γ-decalactone) Dịch chưng cất Loại bỏ dung môi Kết quả: lượng γ- decalactone Tinh sạch, sau đó phân tích GC Chưng cất Chiết bằng dung môi
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Lựa chọn điều kiện lên men trên máy lắc
3.1.1. Lựa chọn tốc độ lắc
Yarrowia lipolytica là nấm men hiếu khí bắt buộc, vì vậy chế độ thông khí sẽ
ảnh hưởng lớn đến khả năng sinh trưởng và tích tụ γ-decalactone trong môi trường lên men. Kết quả được trình bày trong Bảng 3.1. Cho thấy tốc độ lắc thích hợp cho chủng Y. lipolytica VTP5 là 200 vòng/phút, lượng γ-decalactone tích tụ đạt 2,164 g/L. Kết quả củng cho thấy theo sự thay đổi tốc độ lắc, thì sự tăng hay giảm lượng sinh khối và lượng γ-decalactone diễn ra cùng chiều. Điều đó chỉ mới gợi ý rằng lượng sản phẩm tối đa đạt được ở tốc độ 200 v/p như ở đây có thể là do tốc độ lắc ấy sự sinh trưởng của nấm men là tốt nhất. Còn khả năng tạo sản phẩm của mỗi tế bào có là cao nhất ở tốc độ lắc ấy không thì vẫn là câu hỏi để ngỏ, cần có các nghiên cứu chính xác hơn, trước hết là tính lượng sản phẩm trên đơn vị sinh khối khô.
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của tốc độ lắc đến hiệu suất lên men
Tốc độ lắc (vòng/phút)
Lƣợng sinh khối ƣớt (g/L) Lƣợng -decalactone (g/L)
140 38,0 1,892 ± 0,016
200 41,0 2,164 ± 0.025
250 37,5 1,791 ± 0.033
300 35,0 1,477 ± 0,027
3.1.2. Lựa chọn pH môi trƣờng lên men
Số liệu được trình bày trong bảng 3.2 cho thấy: pH 6,0 là thích hợp nhất cho
Y- lipolytica VTP5 sinh trưởng và chuyển hóa dầu thầu dầu thành chất thơm γ-
decalactone, với lượng sinh khối ướt và γ-decalactone đạt giá trị cao nhất, tương ứng là 48,5 g/L và 2,286 g/L sau 4 ngày nuôi cấy.
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của pH môi trường đến hiệu suất lên men
pH môi trƣờng
pH khi kết thúc lên men Sinh khối ƣớt (g/L) Lƣợng -decalactone (g/L) 4,0 3,80 31,0 1,158 ± 0,018 4,5 4,12 35,0 1,732 ± 0,027 5,0 4,32 41,0 2,184 ± 0,038 5,5 4,50 45,0 2,212 ± 0,035 6,0 4,65 48,5 2,286 ± 0,032 6,5 4,70 43,0 1,836 ± 0,026 7,0 4,85 35,5 1,432 ± 0,014
Mỗi chủng nấm men đều có pH môi trường thích hợp riêng cho sự tổng hợp γ-decalactone. Có thể ở điều kiện pH này, tế bào nấm men sản sinh ra một chất nhũ tương hóa giúp lipit hòa tan tốt trong canh trường. Điều này đã được Pagot cùng cộng sự đã đề cập. Theo họ, khi hạt lipit đạt kích thước nhỏ nhất, diện tích tiếp xúc riêng của chúng là lớn nhất, tạo điều kiện thuận lợi cho sự tiếp xúc với tế bào nấm men, giúp cho sự trao đổi chất tạo sản phẩm thứ cấp trong tế bào diễn ra nhanh hơn, mạnh hơn [31].
3.1.3. Lựa chọn thời gian nhân giống
Trong quá trình nhân giống cấp 1, ở điều kiện lắc 200 v/p, nhiệt độ 27oC thì đạt mật độ cao nhất sau 9 giờ tuổi, ở mức 6,5 x 106 tế bào/mL (bảng 3.3) từ thời điểm 12 giờ trở đi, hầu hết tế bào ở dạng khuẩn ty, vì thế chúng tôi không thể xác định được mật độ tế bào theo phương pháp đếm trong buồng đếm hồng cầu trong luận văn này. Tuy nhiên, việc nhân giống cấp 1, với thời gian lâu hơn 9 giờ để có thể có được mật độ tế bào cao hơn 6,5 x 106 tế bào/mL là không kinh tế vì tiêu tốn thêm thời gian và năng lượng.
Bảng 3.3. Sự biến đổi mật độ tế bào theo thời gian nhân giống
Tuổi giống (giờ) Mật độ tế bào (106/mL)
Hình thái tế bào
0 1,0 Hình trứng, trứng dài 6 3,0 Hình trứng, trứng dài
9 6,5 Hình trứng, trứng dài, một số tạo khuẩn ty
12 - Hầu hết tạo khuẩn ty
18 - Hầu hết tạo khuẩn ty
Ghi chú: - Không đếm được vì tế bào hầu hết tạo thành khuẩn ty
3.1.4. Lựa chọn tỷ lệ cấy giống
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của tỷ lệ cấy giống đến hiệu suất lên men trên máy lắc
Tỷ lệ giống (%, v/v) Sinh khối ƣớt (g/L) Lƣợng -decalactone (g/L)
5 38,5 1,918 ± 0,018 10 49,5 2,679 ± 0,042 15 51,5 1,734 ± 0,019 20 45,0 1,527 ± 0,032
Với giống cấp 1 đã đạt mật độ 6,5 x 106 tế bào/mL trong các điều kiện lắc như ở các mục 3.1.3, khi tỷ lệ cấy giống thay đổi từ 5 đến 20% (v/v) thì lượng sinh khối và lượng sản phẩm thay đổi như trong bảng 3.4. Theo đó lượng sản phẩm đạt mức cao nhất 2,679 g/L ứng với tỷ lệ cấy giống 10% (v/v) .
Cũng theo trong bảng 3.4, ở tỷ lệ giống 15% thì lượng sản phẩm giảm xuống, còn lượng sinh khối thì tăng lên so với tỷ lệ giống 10%, lượng sản phẩm tiếp tục giảm khi tỷ lệ giống tăng lên 20%, còn sinh khối cũng giảm. Những hiện tượng này có thể được giải thích rằng, so với tỉ lệ giống 10% thì tỷ lệ giống 5% chưa đủ tạo ra lượng sinh khối cần thiết để tạo nhiều sản phẩm; tỷ lệ giống 15% tạo ra quá nhiều sinh khối khiến chúng phân hủy (tiêu dùng) một phần sản phẩm đã tạo ra; và với tỷ lệ giống 20% thì lượng sinh khối sinh ra phải giảm xuống vì cơ chất không đủ cho chúng, mặc dù chúng đã tiêu thụ một phần sản phẩm.
3.1.5. Lựa chọn thời gian lên men
Kết quả trình bày trong bảng 3.5 cho thấy, với các điều kiện lên men đã lựa chọn trong mục 3.1.1- 3.1.4, chủng Y. lipolytica VTP5 có khả năng tổng hợp lượng γ-decalactone ở mức cao nhất là 2,835 g/L sau 4 ngày lên men. Tới ngày thứ 5, lượng sản phẩm giảm xuống, có thể là do bị tiêu dùng một phần bởi các tế bào.
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của thời gian lên men đến hiệu suất tổng hợp γ-decalactone
của chủng Y. lipolytica VTP5
Thời gian lên men (ngày) Lƣợng -decalactone (g/L)
3 1,753 ± 0,028
4 2,835 ± 0,043
5 2,451 ± 0,037
3.1.6. Ứng dụng phƣơng pháp lên men tiếp dần cơ chất (fed-culture)
Theo một số nghiên cứu đã được công bố, để giảm bớt ảnh hưởng kìm hãm của ricinoleic acid/methyl ricinoleate trong dầu thầu dầu đến sự sinh trưởng của nấm men chuyển hóa dầu này thành γ-decalactone, các tác giả đã sử dụng phương pháp lên men 2 pha [39][41], hoặc phương pháp lên men tiếp dần cơ chất (fed – batch) [34]. Chúng tôi tiến hành nghiên cứu sử dụng phương pháp thứ hai này, theo đó có 3 công thức thí nghiệm: môi trường ban đầu chứa 20, 40, 60 g dầu thầu dầu/L, sau 24 giờ lên men, được tiếp thêm lượng dầu thầu dầu còn lại. Ở công thức đối chứng, môi trường chứa 100 g dầu thầu dầu/ L ngay từ ban đầu.
Kết quả trong bảng 3.6 cho thấy phương thức lên men tiếp dần cơ chất đã nâng cao hiệu suất lên men của Y. lipolytica VTP5; ở cả 3 công thức thí nghiệm lượng sinh khối và lượng sản phẩm đều tăng so với ở công thức đối chứng riêng ở công thức “40+60” cả lượng sinh khối và lượng sản phẩm đều đạt mức cực đại so với các công thức khác.
Kết quả nghiên cứu chứng tỏ dầu thầu dầu có ảnh hưởng ức chế đến sự sinh trưởng của nấm men, thông qua đó làm giảm lượng γ-decalactone thu được nhờ lên men. Phương pháp fed-batch có hiệu quả tốt ở quy mô máy lắc như vừa trình bày, sẽ được ứng dụng ở quy mô nồi lên men 5L và 50L trong các phần tiếp theo.
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của hàm lượng dầu thầu dầu sử dụng ban đầu đến hiệu suất tổng hợp γ-decalactone của chủng Y. lipolytica VTP5
Công thức Sinh khối ƣớt (g/L) -decalactone (g/L)
ĐC: 100 g/L dầu thầu dầu 48,5 2,835 ± 0,039 MT ban đầu: 20 g/L dầu thầu dầu;
sau 24 giờ tiếp thêm 80 g/L (20+80)
50,5 3,386 ± 0,047 MT ban đầu: 40 g/L dầu thầu dầu;
sau 24 giờ tiếp thêm 60 g/L (40+60)
53,5 3,643 ± 0,042
MT ban đầu: 60 g/L dầu thầu dầu; sau 24 giờ tiếp thêm 40 g/L (60+40)
51,0 3,094 ± 0,034
3.1.7. Tóm tắt kết quả lựa chọn điều kiện lên men trên máy lắc
Trong Bảng 3.7 có nêu lên các thông số đã được lựa chọn một cách riêng lẻ (trong khi cố định các thông số khác) để đạt được lượng sản phẩm cao nhất. Các thông số đã được lựa chọn này sẽ được áp dụng tiếp tục cho lên men ở quy mô 5L và 50L.
Bảng 3.7. Tổng hợp kết quả lựa chọn điều kiện lên men sinh γ-decalactone nhờ Y.
lipolytica VTP5 ở quy mô máy lắc
Điều kiện lên men Thông số thích hợp (riêng lẻ) Lƣợng -decalactone (g/L)
Tốc độ lắc 200 vòng/phút 2,164 ± 0,025
pH môi trường 6 2,286 ± 0,032
Tỷ lệ giống cấp 1 10% ( nuôi 27oC, 200 v/p, 9h) 2,679 ± 0,042
Thời gian lên men 4 ngày 2,835 ± 0,043
Lên men có tiếp dần cơ chất
40 g/L dầu thầu dầu ban đầu, sau 24 giờ bổ sung 60 g/L
3,643± 0,042 Năng suất chuyển hóa (mg γ-decalactone/giờ) = (số mg
γ-decalactone tại thời điểm cực đại) / (9 giờ nhân giống + thời gian để đạt sản phẩm cực đại)
3643=37,95x(9+88)
3.2. Nghiên cứu các phƣơng thức lên men ở quy mô 5L và 50L
3.2.1. Lên men ở quy mô 5L
3.2.1.1. Lên men theo phương thức (batch culture)không khống chế pH và DO
Các điều kiện lên men cơ bản gồm: nồi lên men có dung tích 5L (dung tích làm việc 3L), môi trường chứa 100 g/L (10%) dầu thầu dầu, tỷ lệ giống cấp 1 là 10%, tốc độ khuấy 200 vòng/phút, cấp khí 0,7 L/L môi trường/phút, nhiệt độ 27oC. Với phương thức lên men “không khống chế pH và DO”, kết quả (Hình 3.1) cho thấy:
- Môi trường lên men sau khi thanh trùng có pH 5,42. Trong 8 giờ đầu pH giảm nhẹ xuống 5,02; sau đó tăng nhanh, đạt giá trị cao nhất là 7,0 ở 24 giờ lên men, rồi giảm dần đến 4,53 khi kết thúc lên men ở 96 giờ.
- Hàm lượng ôxy hòa tan trong môi trường đạt 75,3% khi bắt đầu lên men, giảm nhanh xuống 5% sau 16 giờ, sau đó giảm nhẹ dần và giữ ở 0,2% từ 64 giờ cho đến khi kết thúc lên men ở 96 giờ. Điều này cho thấy nấm men Y. lipolytica VTP5 sinh trưởng và tiêu thụ ôxy với mức độ cao.
- Sinh khối nấm men tăng nhanh, đạt giá trị cao nhất là 5,31 gam sinh khối ướt/100 mL (53,1 g/L) ở 48 giờ, sau đó giảm nhẹ còn 4,85 g/100 mL khi kết thúc lên men.
- γ-decalactone bắt đầu được tích tụ trong môi trường lên men sau 24 giờ, tăng dần và đạt giá trị cao nhất là 4,264 g/L sau 88 giờ lên men, sau đó giảm còn 3,920 g/L khi kết thúc lên men ở 96 giờ. Không có hiện tượng tế bào nấm men bị chết khi nồng độ γ-decalactone trong môi trường nuôi cấy tăng dần.
Như vậy, khi lên men theo mẻ ở nồi lên men dung tích 5L, theo phương thức “không khống chế pH và DO”, hiệu suất chuyển hóa sinh học dầu thầu dầu thành γ- decalactone tăng 50% (đạt 4,264 g/L) so với lên men trên máy lắc (2,835 g/L). Sinh khối tế bào nấm men tăng không nhiều so với khi nuôi cấy trên máy lắc. Tuy nhiên, thời gian lên men vẫn kéo dài.
Lượng sản phẩm tăng lên như trên, so với lên men trên máy lắc có thể liên quan đến tác dụng tốt của sự khuấy, sục khí: tính chất nhũ hóa và sự tương tác trong các pha môi trường lỏng của dầu và nước được cải thiện, khiến dầu tiếp xúc tốt hơn với tế bào để được chuyển hóa thành sản phẩm. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với nhiều công trình của các tác giả khác [7].
Hình 3.1. Động học quá trình lên men theo phương thức batch culture “không khống chế pH và DO” trên nồi lên men dung tích 5L.
Để nâng cao hơn nữa hiệu suất chuyển hóa dầu thầu dầu thành γ-decalactone, chúng tôi tiếp tục các nghiên cứu các phương thức lên men khác nhau như trong các phần dưới đây.
3.2.1.2. Lên men theo phương thức Batch culture “không khống chế pH có khống chế DO”
Theo phương thức này, kết quả nêu trong hình 3.2 A cho thấy :
+ DO trong môi trường lúc đầu đạt 97,5%, giảm xuống 48,2% sau 8 giờ lên men. Sau đó để giữ cho hàm lượng DO trong môi trường có giá trị khoảng 40%, tốc độ cánh khuấy được tăng lên và dao động trong khoảng 300 - 500 vòng/phút.
+ Sinh khối nấm men tăng nhanh, đạt 5,58 gam sinh khối ướt/100 mL sau 40 giờ lên men và tiếp tục tăng nhẹ đến 6,30 g/100 mL và giữ ở mức này cho đến khi kết thúc lên men ở 96 giờ.
+ Lượng γ-decalactone đạt 5,22 g/Lít sau 72 giờ nuôi cấy, tăng 22,4% so với phương thức khi lên men không điều chỉnh pH môi trường ban đầu và không khống chế DO (4,264 g/L).
3.2.1.3. Lên men theo phương thức Batch culture “có khống chế pH và DO”
Hình 3.2 B cho thấy kết quả của phương thức lên men này như sau:
+ Sinh khối đạt mức cao nhất 7,88-7,85 g/100mL trong khoảng 56 đến 64 giờ lên men, tăng 24,3% so với phương thức “không khống chế pH có khống chế DO” (6,30g/100mL), sau đó giảm nhẹ đến 7,55g/100mL ở thời điểm 96 giờ (kết thúc lên men).
+ Lượng γ-decalactone đạt 6,234 g/L sau 64 giờ lên men, tăng 46% so với ở phương thức không khống chế pH và có khống chế DO (5,22 g/L).
Như vậy, trong phương thức này, nhờ sự tăng lượng không khí vào môi trường để cố định và khống chế hàm lượng ôxy hòa tan, mà sự sinh trưởng của nấm men mạnh hơn và hàm lượng γ-decalactone cũng tăng theo. Hơn nữa, khi khống chế