a.Trong nước
Ở Việt Nam, việc nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học để sản xuất chất thơm bằng con đường sinh học như sinh tổng hợp hoặc sinh chuyển hóa còn rất ít.
Năm 1995-2000, dựa vào phản ứng ozon hóa từ dầu thầu dầu. Bùi Quang Thuật đã tổng hợp được các chất có giá trị cao như [R] -decalactone, [R] - undecalactone, diacetate [R]-1,4-decanodiol và khoảng 20 hợp chất thơm khác có hoạt tính quang học và sinh học, có thể sử dụng tốt trong công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm và dược phẩm [4].
Năm 2003, trong khuôn khổ nhiệm vụ “Bảo tồn và lưu giữ nguồn gen vi sinh vật công nghiệp thực phẩm”, Viện Công nghiệp Thực phẩm lần đầu tiên đã tiến hành phân lập và khảo sát sơ bộ một số chủng nấm men có khả năng chuyển hóa
dầu thầu dầu thành chất thơm. Từ các kết quả phân lập mới và khảo sát các chủng có sẵn trong sưu tập giống, nhóm đề tài đã tuyển chọn được 3 chủng nấm men có khả năng chuyển hóa axit ricinoleic từ dầu thầu dầu để tạo chất thơm trong quá trình nuôi cấy. Chất thơm đã được sơ bộ xác định thành phần bằng phương pháp sắc ký khí (GC), -decalactone tạo ra đã được sơ bộ định lượng và tách chiết. Hiệu suất tổng hợp -decalactone bằng các chủng nấm men của Viện Công nghiệp Thực phẩm đạt cao nhất là 0,24% (240 mg/L môi trường nuôi cấy) đối với chủng KFP 346 [3].
Năm 2003, Lại Thị Ngọc Hà, đã công bố kết quả nghiên cứu về một số yếu tố có ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp -decalactone của chủng nấm men Yarrowia
lipolytica W29. Ở điều kiện nuôi cấy trong phòng thí nghiệm với cơ chất dầu thầu dầu
20 g/L, pH=7,0, tốc độ lắc 200 vòng/phút, chủng nấm men này tổng hợp được 621mg
-decalactone/lít môi trường [1].
b. Ngoài nước
Nhu cầu về chất thơm sử dụng trong các lĩnh vực chế biến thực phẩm, đồ uống, mỹ phẩm, dược phẩm và chất tẩy rửa đạt khoảng 16-20 tỷ đô la Mỹ hàng năm nhưng vẫn chủ yếu là các chất thơm được tổng hợp hóa học và chỉ rất ít trong chúng được sản xuất bằng con đường tách chiết từ thực vật hoặc qua sự trao đổi chất của vi sinh vật.
- lactone và -lactone là thành phần chủ yếu tạo nên hương thơm của các nguồn hương tự nhiên như các loại quả và một số sản phẩm lên men. Hương thơm của các lactone là do cấu trúc vòng lactone quyết định, độ dài của mạch cacbon và cấu trúc đồng phân quang học. - decalactone, chất hương có giá trị lớn trong nhiều ngành công nghiệp và cho đến nay là chất thơm chính được tổng hợp bằng con đường sinh học. Sản lượng -decalactone càng ngày càng tăng, dẫn đến giá thành giảm dần. Năm 1997, sản lượng -decalactone đạt 10 tấn làm giảm giá thành đáng kể từ trên 12.000 đô la Mỹ/kg (năm 1986) xuống còn 500 đô la Mỹ/kg năm 1998 và 300 đô la Mỹ/kg năm 2003. Các nhà sản xuất chất thơm rất quan tâm đến việc hạ giá thành sản xuất và điều này đã dẫn tới sự thay đổi trong định hướng nghiên cứu ở lĩnh vực này [20].
Một số kết quả nghiên cứu khoa học về chuyển hóa cơ chất tạo thành chất thơm dạng lactone nhờ sử dụng vi sinh vật đã được thống kê như sau:
Farbood và Willis (1985) sử dụng các chủng nấm men Yarrowia lipolytica,
Aspergillus oryzae, Geotrichum klebahnii và Candida sp. Để tổng hợp -
decalactone từ các cơ chất chính là dầu thầu dầu, dầu thầu dầu cùng với enzyme lipase, dầu thầu dầu thủy phân ở quy mô phòng thí nghiệm trong các bình tam giác có khuấy. Tuy nhiên, hiệu suất thu được còn thấp, chỉ đạt 0,69g/L môi trường sau 1 tuần nuôi cấy [17].
Trong một nghiên cứu gần đây, Alchihab M và cộng sự (2010) đã sử dụng các chủng nấm men Rhodotorula aurantiaca phân lập từ Nam Cực để lên men dầu thầu dầu tạo -decalactone. Nồng độ γ-decalactone cao nhất đạt 5,8g/L trên môi trường chứa 20g/L dầu thầu dầu [8].
Nồng độ γ-decalactone tích tụ trong canh trường cao nhất hiện nay (12,3 g/L) được ghi nhận bởi nhóm tác giả Đức thực hiện trên Yarrowia lipolytica HR 145 (DSM 12397), môi trường chứa 0,5% ure, khoáng chất, vitamin, 0,07% Tween 80, và 5% dầu thầu dầu, sau khi đã tối ưu hóa điều kiện lên men. Kỹ thuật này đã được đăng ký bản quyền công nghệ bởi công ty Haarmann & Reimer GmbH [33].
Groguenin và cộng sự năm 2004, sau khi xác định được các đặc tính của một số enzyme của con đường β - oxy hóa trong nấm men Yarrowia lipolytica, đã nghiên cứu loại bỏ một số enzime hoạt động trong quá trình chuyển hóa chuỗi ngắn. Khi loại bỏ được các enzyme này, đã nâng cao được hiệu suất chuyển hóa và tích lũy các hợp chất hương thơm lớn hơn 4 lần [24].
CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.1. Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị, dụng cụ và môi trường nghiên cứu
2.1.1. Vi sinh vật
Trong nghiên cứu này, chủng nấm men Yarrowia lipolytica VTP-5 được dùng để chuyển hóa dầu thầu dầu thành - decalactone. Đây là chủng nấm men chuyển hóa chất béo (oleaginous yeast), trước đây được phân lập từ nem chua, hiện đang được lưu giữ tại Bộ môn Công nghệ Enzyme và Protein - Viện Công nghiệp Thực phẩm.
2.1.2. Hóa chất
Bảng 2.1 Các hoá chất sử dụng.
2.1.3. Thiết bị
Các thiết bị phụ vụ cho quá trình nghiên cứu và thực hiện thí nghiệm bao gồm các loại thiết bị và nguồn gốc như sau:
Hóa chất Nguồn gốc Hóa chất Nguồn gốc HCl bão hòa 20% Meck-Đức Albumin Sigma-Mỹ Yeast extract Wako-Nhật NAOH 6M Meck-Đức Tryptone Wako-Nhật Dầu phá bọt Sigma-Mỹ
Agar Wako-Nhật Etanol Meck-Đức
D- Glucose Wako-Nhật -decalacton chuẩn Meck-Đức Etyl axetat Wako-Nhật Dietyl Ether Meck-Đức
Butanol Meck-Đức Tween 80 Sigma-Mỹ
Malt extract Wako-Nhật Castor oil Việt Nam
Bảng 2.2 Thiết bị trong nghiên cứu
STT Thiết bị Nguồn gốc STT Thiết bị Nguồn
gốc
1 Máy đo pH Ohaus Thụy Điển 15 Máy ly tâm Đức 2 Cân phân tích
Ohaus Thụy Điển 16 Tủ lạnh sâu -20
0C Nhật
3 Máy khuấy từ Nhật 17 Máy khuấy trộn
Vontex RotoLab OSI 4 Tủ nuôi cấy Nhật Bản 18 Tủ cấy vô trùng Nhật 5 Lò vi song Sanyo
EM Nhật 19 Tủ Hốt Mỹ
6 Máy lắc ổn nhiệt Đức 20 Thiết bị cô quay chân
không Buchi RE 111 Thụy sỹ 7 Tủ sấy Việt Nam 21 Hệ thống GC Thermo
Finigan Mỹ
8 Máy ảnh Canon
Isus 1200 Nhật 22
Thiết bị đông khô
Christ Đức
9 Máy đo OD Mỹ 23 Tủ cấy Box Đức
10 Máy lắc Gyrmax Mỹ 24 Tủ nuôi cấy Sanio Nhật 11 Tủ sấy Memmert Trung Quốc 25 Kính hiển vi Olympus Nhật 12 Nồi khử trùng
Study Nga 26
Thiết bị lên men 5L
New Brunswick Mỹ 13 Thiết bị lên men
50L Marubishi Nhật 27
Máy ly tâm CeFa –
Z41, 60 lít/giờ Đức 14 Thiết bị chưng cất
2.1.4. Môi trƣờng (g/L)
* Môi trường giữ giống (YMA)
Yeast extract 3 Malt extract 3 Peptone 5 Glucose 10 Agar 20
* Môi trường hoạt hóa giống: Môi trường YM dịch thể
Yeast extract 3 Malt extract 3 Peptone 5 Glucose 10
* Môi trường nhân giống
Peptone 20 Yeast extrac 10 Glucose 20
* Môi trường lên men
Dầu thầu dầu (castor oil) 100 Pepton 20 Tween 80 1
2.2. Phƣơng pháp
2.2.1. Nhân giống và lên men trên máy lắc * Nhân giống * Nhân giống
Cấy 10 vòng que cấy giống từ ống thạch nghiêng vào bình tam giác chứa 50mL môi trường nhân giống, nuôi lắc 200 v/p, trong 9h ở 27ºC để đạt mật độ tế bào cao nhất (6,5.106/mL). Huyền dịch thu được này được coi là giống cấp 1 để tiếp giống cấy vào các môi trường lên men.
* Lên men trên máy lắc
Việc lên men trên máy lắc, được diễn ra sau tiếp giống cấp 1 vào các bình chứa 100 mL môi trường lên men trong thời gian 4 ngày, ở nhiệt độ 27ºC, tốc độ lắc 200 v/p. Các khảo sát sau đây đã được tiến hành đối với lên men lắc:
a) Khảo sát tốc độ lắc
Các tốc độ lắc 140, 200, 250, 300 v/p đã được khảo sát đối với 4 bình tam giác mỗi bình chứa 100 mL môi trường lên men.
b) Khảo sát pH môi trường ban đầu: pH= 4; 4,5; 5; 5,5; 6; 6,5; 7
Các pH ban đầu khác nhau (4; 4,5; 5; 5,5; 6; 6,5; 7), đã được khảo sát đối với 7 bình tam giác 500 mL, mỗi bình chứa 100 mL môi trường lên men. Tiếp giống cấp 1 vào môi trường lên men, tiến hành lên men trong 4 ngày ở nhiệt độ 27ºC, tốc độ lắc 200 v/p.
c) Khảo sát tỉ lệ tiếp giống (tỉ lệ cấy)
Khảo sát các tỉ lệ tiếp giống 5%, 10%, 15%, 20%, thể tích môi trường lên men. Nuôi giống trong 9h, Sau đó tiếp giống vào các bình lên men đã được chuẩn bị trước với các tỉ lệ giống như trên. Lên men trong thời gian 4 ngày, ở nhiệt độ 27ºC, tốc độ lắc 200 v/p.
d) Khảo sát thời gian lên men
Thời gian lên men được khảo sát là 3, 4, 5, 6 ngày, tất cả được tiếp giống cấp 1 với tỉ lệ 10% (6,5.106 tế bào/mL), có pH ban đầu là 5,4 ở 27oC, lắc 200 v/p.
2.2.2. Lên men theo mẻ trên nồi 5L
Các thông số lên men:
Nồi lên men có thể tích làm việc 3 L; tỉ lệ tiếp giống 10% (v/v), nhiệt độ 270C, khuấy 200 v/p, cấp khí 0,7 L/L môi trường/phút; tần suất lấy mẫu phân tích: 8 giờ một lần; thời điểm kết thúc lên men: 64h.
2.2.3. Lên men theo mẻ - có tiếp dần cơ chất, trên nồi 5L
Khác với lên men theo mẻ đã được trình bày ở mục 2.2.2, nồng độ cơ chất (dầu thầu dầu) ban đầu trong môi trường lên men chỉ là 40% nồng độ tổng, tức
120g/3L. Phần còn lại, 60% tức 180g/3L được tiếp dần vào nồi lên men ở thời điểm 16h lên men, với tốc độ 2mL/phút. Tần suất lấy mẫu như ở lên men theo mẻ.
2.2.4.Lên men theo mẻ trên nồi 50L
Các thông số lên men như sau: -Thể tích làm việc của nồi 30L
- Lên men ở điều kiện khuấy 200 vòng/phút, nuôi 270C, cấp khí 0,7L/L - Tần suất lấy mẫu 4h một lần, kết thúc lên men tại thời điểm 64h
2.2.5. Lên men theo mẻ có - tiếp dần cơ chất, trên nồi 50L
Khác với ở mục 2.2.4 ở đây nồng độ dầu thầu dầu sử dụng ban đầu là 40% nồng độ tổng, tức 1200g/30L, phần còn lại, 60% tức 1800g/30L được tiếp dần vào nồi lên men ở thời điểm 16h với tốc độ 20mL/phút, tần suất lấy mẫu 4h một lần, kết thúc lên men tại thời điểm 64h.
2.2.6. Đếm số lƣợng tế bào bằng buồng đếm hồng cầu
Dụng cụ: buồng đếm hồng cầu Thomas. Buồng đếm này có 16 khối lập phương,
mỗi khối lớn được chia thành 16 khối nhỏ. Kích thước khối như sau: Chiều sâu các khối: 1/10mm
Chiều dài cạnh khối nhỏ: 1/20mm
Diện tích đáy khối nhỏ: (1/20)2 = 1/400mm2 Thể tích một khối nhỏ: (1/20)3 = 1/4000mm3
Thể tích một khối lớn: 16x 1/4000mm3 = 1/250mm3 Thể tích buồng đếm: 16x 1/250mm3= 0,064 mm3
Tiến hành: Pha loãng mẫu (đảm bảo mỗi ô lớn có từ 5 đến 10 tế bào). Dùng
pipet hút nhanh 1 giọt mẫu nhỏ lên buồng đếm, phủ lá kính. Soi đếm trên kính hiển vi. Đếm số lượng tế bào trong 5 khối lớn.
Tính kết quả theo công thức: N= n/v.f
Trong đó:
N: số tế bào/1mL dịch mẫu
v: thể tích khối lớn = 1/250mm3 f: hệ số pha loãng mẫu
Để xác định số tế bào sống/tổng số tế bào trong mẫu: Tiến hành nhuộm mẫu bằng xanh Metylen (1 giọt mẫu: 1 giọt xanh metylen), các tế bào chết sẽ bắt màu xanh.
2.2.7. Lactone hóa dịch sau lên men 2.2.7.1. Lactone hóa có gia nhiệt 2.2.7.1. Lactone hóa có gia nhiệt
Dịch sau lên men đã loại bỏ sinh khối được hạ pH về 2 bằng HCl 6 N (để cho axit 4-hydro decanoic đóng vòng thành γ-decalctone), thủ tục này được thực hiện bằng lắc đều rồi đun nóng đến 85 C - 90 C trong thời gian 10-30 phút.
Sau thủ tục này sẽ thu được dịch lactone hóa 1 (có gia nhiệt) chứa γ- decalctone, dịch này được dùng để tách chiết γ-decalctone bằng dung môi.
2.2.7.2. Lactone hóa không gia nhiệt
Dịch sau lên men đã loại bỏ sinh khối được chia làm 3 mẫu: mẫu 1 giữ nguyên không chỉnh pH; mẫu 2 chỉnh pH về 1,5; mẫu 3 chỉnh pH về 2, sau thủ tục này sẽ thu được dịch lactone hóa 2 (không gia nhiệt) chứa -decalactone, dịch này để dùng tách chiết -decalactone (mục 2.2.9), hoặc chưng cất thành dịch ngưng tụ chứa - decalactone (mục 2.2.8) cũng dùng để tách chiết.
2.2.8.Chƣng cất dịch lên men đã đƣợc lactone hóa
Dịch lactone hóa ở pH 2 như trên, được chưng cất bằng thiết bị Clevenger ở nhiệt độ 100ºC để thu nhận dịch ngưng tụ chứa các cấu tử hương thơm.
2.2.9. Tách chiết -decalactone bằng dung môi
Dịch lactone hóa 1 và 2 cũng như dịch ngưng tụ, ở các mục 2.2.7-2.2.8, được dùng làm nguồn để thu nhận γ-decalactone bằng cách chiết rút bằng dung môi: 1,5 ml mỗi dung dịch đó được bổ xung 1,5 ml dung môi diethyl ether, lắc nhẹ 1,5 phút, để yên và dùng pipet hút lấy phần dịch phía trên chính là dịch chiết chứa - decalactone.
2.2.10. Loại bỏ dung môi khỏi dịch chiết
bị này như sau: dịch chiết được hút vào bình cầu crudema hoặc bình cầu cô quay của thiết bị ở nhiệt độ 45ºC, tới khi diethyl ether bay hết. Dùng pipet hút lượng dịch cô còn lại (chứa γ-decalactone) được phân tích bằng GC.
2.2.11 Làm sạch dịch chiết cô đặc
2.2.11.1 Làm sạch dịch chiết cô đặc bằng cách rửa kiềm
Dịch chiết cô đặc chứa (γ-decalactone) được làm sạch bằng cách rửa bằng
kiềm (NaOH pH 11-12), sau đó chiết lại bằng diethyl ether, rồi loại bỏ dung môi bằng thiết bị cô quay chân không, đến khi dung môi bay hơi hết. Dịch thu được sau thủ tục này được gọi là dịch chiết sạch 1 (rửa bằng kiềm) sẽ được định lượng γ- decalactone bằng GC hoặc dùng cho thủ tục cuối cùng: đánh giá cảm quan.
2.2.11.2 Làm sạch dịch chiết cô đặc bằng Na2SO4 khan
Dịch sau cô đặc được pha vào cồn tuyệt đối (tỷ lệ 20 ml dịch cồn/50 ml dịch cô đặc) rồi loại bỏ dung môi nhờ thiết bị cô quay chân không tới khi cồn và diethyl ether còn sót lại bay hơi hết, dịch thu được tiếp tục được làm sạch bằng Na2SO4
khan. Dịch thu được sau thủ tục này được gọi là dịch chiết sạch 2 (bằng Na2SO4).
2.2.12. Đánh giá cảm quan
Đánh giá sự sinh trưởng nấm men thông qua khối lượng sinh khối.
Đánh giá màu sắc dịch sau lên men thông qua sự đồng đều của màu sắc trong các bình sau lên men.
2.2.13. Phân tích định lƣợng -decalactone bằng sắc ký khí
Sử dụng phương pháp sắc ký khí (Gas Chromatography-GC) được thực hiện tại Trung tâm phân tích, Viện Khoa học hình sự, Bộ Công An
Nguyên lý: Mẫu được phân tích GC bơm vào trong cột và theo dòng khí
mang (thường là nitơ) đưa đến cột sắc ký (pha tĩnh). Mẫu khi qua cột này sẽ được hấp phụ lên trên pha tĩnh đó. Sau đó, các chất lần lượt tách khỏi cột theo dòng khí ra và được ghi nhận bởi đầu dò. Từ các tín hiệu nhận được, máy tính sẽ xử lý và biểu hiện kết quả bằng sắc ký đồ. Hàm lượng mỗi chất được xác định nhờ thời lượng lưu trên sắc ký đồ.
Thực hiện:
Dùng pipet sạch hút chính xác 100 μl mẫu phân tích GC sau đó bổ xung dung dịch chuẩn: γ-decalactone (mg/mL), cho vào ống Eppendort sạch đã thanh trùng có đánh số kí hiệu mẫu phân tích GC.
Thông số thiết bị sắc kí:
+ Thiết bị GC Aligent 6890 A/ USA + Thể tích mẫu tiêm: 2 μl
+ Khí mang: N2
+ Detector ion hóa ngọn lửa (FID), khí đốt của FID: H2 + O2
+ Cột HP1: 30μm, nhiệt độ từ 80OC- 250OCtrong 10 phút, kích thước cột 30μm x 250μm x 0.25 μm.
Sơ đồ quá trình lên men thu nhận -decalactone: Chủng nấm men nghiên cứu Hoạt hóa Dịch môi trường YM