yếu liên quan đến độc lực của vi khuẩn
Yêu cầu về tổ hợp mồi:
- Thành phần của tổ hợp mồi có thể có ìt nhất 3 cặp mồi của 3 gen khác nhau luôn phải có cặp mồi đặc hiệu chung cho vi khuẩn S. suis
- Kìch thƣớc sản phẩm PCR khác nhau để có thể phân biệt đƣợc
- Có cùng nhiệt độ bắt cặp
- Khả năng cạnh tranh thấp
- Đạt độ nhạy và đặc hiệu
Thực hiện theo yêu cầu trên, cụ thể trong nghiên cứu này, mỗi tổ hợp mồi bao gồm 1 cặp đặc hiệu cho S. suis + 1 cặp đặc hiệu cho typ huyết thanh 2 + 1 cặp đặc hiệu cho Suilysin/ hoặc 1,2 yếu tố độc lực phổ biến khác.
Bảng 2.2. Các tổ hợp mồi đƣợc sử dụng trong thử nghiệm
Tổ hợp Các loại mồi Đặc hiệu cho S. suis Typ huyết thanh 2 Enzym ly giải tế bào Enzym khác Protein ngoại bào Tổ hợp 1 16S rDNA Cps2J Sly - - Tổ hợp 2 16S rDNA Cps2J Sly arcA - Tổ hợp 3 16S rDNA Cps2J Sly - Mrp Tổ hợp 4 16SrDNA Cps2J Sly arcA Mrp Tổ hợp 5 Gdh Cps2J Sly - - Tổ hợp 6 Gdh Cps2J Sly arcA - Tổ hợp 7 Gdh Cps2J Sly - Mrp Tổ hợp 8 Gdh Cps2J Sly arcA Mrp Tổ hợp 9 Strep2 Cps2J Sly - - Tổ hợp 10 Strep2 Cps2J Sly arcA - Tổ hợp 11 Strep2 Cps2J Sly - Mrp Tổ hợp 12 Strep2 Cps2J Sly arcA mrp Tổ hợp 13 16S rDNA Cps2JJ Sly - - Tổ hợp 14 16S rDNA Cps2JJ Sly arcA -
Đặng Thị Kiều Oanh 45 Cao học K18
Tổ hợp 15 16S rDNA Cps2JJ Sly - Mrp Tổ hợp 16 16SrDNA Cps2JJ Sly arcA Mrp Tổ hợp 17 Gdh Cps2JJ Sly - - Tổ hợp 18 Gdh Cps2JJ Sly arcA - Tổ hợp 19 Gdh Cps2JJ Sly - Mrp Tổ hợp 20 Gdh Cps2JJ Sly arcA Mrp Tổ hợp 21 Strep2 Cps2JJ Sly - - Tổ hợp 22 Strep2 Cps2JJ Sly arcA - Tổ hợp 23 Strep2 Cps2JJ Sly - Mrp Tổ hợp 24 Strep2 Cps2JJ Sly arcA Mrp
Kỹ thuật sử dụng để đánh giá:
- Kỹ thuật PCR thông thƣờng (đơn mồi và đa mồi đƣợc xây dựng trong đề tài)
- Kỹ thuật điện di
+ Sử dụng thạch điện di Nusieve GTG Agarose và „Seakem GTG Agarose‟ pha tỷ lệ 1/1 (2%) ; 1,5/1 (2,5%) và 2/1 (3%) trong đệm điện di (TAE hoặc TBE).
+ Pha mẫu điện di : 2µl Loading buffer + 8µl sản phẩm PCR (1 giếng)
+ Chạy điện di ở điện thế 100V /30 phút.
+ Nhuộm sản phẩm điện di bằng Red Safe.
2.2.3. Nghiên cứu tối ƣu chu trình nhiệt
Thực nghiệm thay đổi các điều kiện về nhiệt độ biến tình, thời gian biến tình, nhiệt độ bắt cặp, thời gian bắt cặp, thời gian kéo dài, số chu kỳ, bổ sung thêm chu trính nhiệt phụ... để chọn ra chƣơng trính PCR đa mồi thìch hợp với mục tiêu “phát hiện S. suis và một số yếu tố độc lực phổ biến”
Kỹ thuật sử dụng trong suốt nghiên cứu là PCR với các chƣơng trính nhiệt thay đổi để lựa chọn những điều kiện cho hiệu quả cao nhất.
Đặng Thị Kiều Oanh 46 Cao học K18
Bảng 2..3. Các chu trình PCR đa mồi đƣợc thử nghiệm
TT Giai đoạn đầu Giai đoạn chính Giai đoạn
sau cùng
Ghi chú
1 960C (3‟) 940C (30”); 550C (30”); 720C (1‟);35 chu kỳ
720C (5‟) Thêm giai đoạn nhiệt độ cao lúc khởi đầu 2 960C (3‟) 940C (30”);550 C (30”); 720C (1‟)40 chu kỳ 720C (5‟) CT1+Tăng số chu kỳ chình 3 960C (3‟) 940C (30”);550 C (30”); 720C (1‟); 35 chu kỳ
720C (5‟) CT1+Tăng thời gian bắt cặp
4 960C (3‟) 940C (30”);550
C (60”); 720C (1‟); 40 chu kỳ
720C (5‟) CT1+Tăng số chu kỳ chình + Tăng thời gian bắt cặp
5 960C (3‟) 940C (30”); 550C (30”); 720C (1‟);35 chu kỳ
720C (10’) CT1 + Tăng thời gian kéo dài cuối cùng 6 960C (3‟) 940C (30”); 600C (30”); 720C (1‟);35 chu kỳ 720C (5‟) CT1 + tăng nhiệt độ bắt cặp 7 960C (3‟) 940C (30”); 600C (30”); 720C (1‟)40 chu kỳ 720C (5‟) CT2 + tăng nhiệt độ bắt cặp 8 960C (3‟) 940C (30”); 600C (30”); 720C (1‟); 35 chu kỳ 720C (5‟) CT3 + tăng nhiệt độ bắt cặp 9 960C (3‟) 940C (30”); 600C (60”); 720C (1‟); 40 chu kỳ 720C (5‟) CT4 + tăng nhiệt độ bắt cặp 10 960C (3‟) 940C (30”); 600C (30”); 720C (1‟);35 chu kỳ 720C (10’) CT5 + tăng nhiệt độ bắt cặp 11 950C (3‟); 600C (30”); 720C (1‟), 3 chu kỳ 940C (30”); 600C (30”); 720C (1‟);35 chu kỳ 720C (5‟) CT phụ + CK8 12 950C (3‟); 600C (60”); 720C (1‟), 3 chu kỳ 940C (30”); 600C (30”); 720C (1‟);35 chu kỳ
720C (5‟) CT11+Tăng thời gian bắt cặp của chu trính phụ 13 950C (3‟); 600C (60”); 720C (1‟), 3 chu kỳ 940C (30”); 600C (60”); 720C (1‟);35 chu kỳ
720C (5‟) CT12+ Tăng thời gian bắt cặp của chu trính chình 14 950C (3‟); 600C (60”); 720C (1‟), 3 chu kỳ 940C (30”); 600C (60”); 720C (1‟);40 chu kỳ
720C (5‟) CT 13 + Tăng thêm chu kỳ chình
Đặng Thị Kiều Oanh 47 Cao học K18 15 950C (3‟); 600C (60”); 720C (1‟), 3 chu kỳ 940C (30”); 600C (60”); 720C (1‟);40 chu kỳ
720C (7’) CT14 + Tăng thời gian kéo dài cuối cùng 16 960C (3‟); 600C (60”); 720C (1‟), 3 chu kỳ 940C (30”); 600C (60”); 720C (1‟);40 chu kỳ 720C (7’) CT15 + Tăng nhiệt độ chu trính phụ 17 960C (3‟); 600C (30”); 720C (1‟), 3 chu kỳ 940C (30”); 600C (30”); 720C (1‟);40 chu kỳ
720C (7’) CT16 + Giảm thời gian bắt cặp
2.2.4. Nghiên cứu tối ƣu các thành phần tham gia phản ứng
Thực nghiệm đánh giá ảnh hƣởng của hàm lƣợng các chất tham gia phản ứng và một số chất có thể gây ức chế phản ứng PCR có mặt trong mẫu bệnh phẩm dịch não tủy (các dNTP, Taq polymerase, muối MgCl2, NaCl, chất xử lý nhày...): thay đổi hàm lƣợng, đánh giá bằng PCR đa mồi đã đƣợc tối ƣu điều kiện ở trên.
Lựa chọn thạch điện di và nồng độ thạch điện di để đảm bảo phát hiện sản phẩm PCR đa mồi.
2.2.5. Nghiên cứu mức độ phát hiện vi khuẩn S. suis và một số yếu tố độc lực của vi khuẩn bởi quy trình PCR đa mồi đƣợc xây dựng trong nghiên cứu. Tính của vi khuẩn bởi quy trình PCR đa mồi đƣợc xây dựng trong nghiên cứu. Tính ổn định của PCR đa mồi.
- Sử dụng bệnh phẩm mô phỏng chứa DNA đã tinh chế của vi khuẩn ở một dải nồng độ từ 106 đến 1 copy/µl (là sản phẩm của 2. 2. 1)
- Sử dụng tổ hợp mồi (là sản phẩm của 2.2. 2)
- Sử dụng chƣơng trính PCR đa mồi đƣợc xây dựng (là sản phẩm của 2. 2. 3)
- Sử dụng các thành phần tham gia phản ứng PCR ở mức độ tối ƣu ((là sản phẩm của 2. 2. 4)
- Phát hiện sản phẩm PCR bằng phƣơng pháp điện di.
- Phản ứng đƣợc lặp lại 10 lần để đánh giá khả năng bền vững và ổn định của phƣơng pháp phát hiện bằng PCR đa mồi.
Đặng Thị Kiều Oanh 48 Cao học K18
2.2.6. Đánh giá tính đặc hiệu của các cặp mồi (khả năng bắt cặp chéo) với những vi khuẩn phổ biến gây hội chứng lâm sàng viêm màng não giống S. suis
Những trính tự mồi đƣợc sử dụng trong nghiên cứu này đều là những trính tự tham khảo từ những bài báo Khoa học đăng trên các tạp chì uy tìn, nên tình đặc hiệu của những cặp mồi này đã đƣợc khẳng định. Tuy nhiên, chúng tôi cũng vẫn sử dụng một số chủng vi khuẩn thƣờng gây bệnh viêm màng não mủ giống S. suis hoặc có đặc điểm cấu tạo giống S. suis (có vỏ polysaccarit, có enzyme ly giải....) để kiểm tra, đánh giá thêm tình đặc hiệu của trính tự mồi cũng nhƣ của quy trính phản ứng PCR đa mồi đƣợc xây dựng trong đề tài.
- Sử dụng bệnh phẩm mô phỏng chứa DNA đã tinh chế của vi khuẩn ở một nồng độ, chọn nồng độ 106 vk/µl.
- Sử dụng tổ hợp mồi đƣợc lựa chọn
- Sử dụng chƣơng trính PCR đa mồi tối ƣu đƣợc xây dựng
- Sử dụng các thành phần tham gia phản ứng PCR ở mức độ tối ƣu
- Phát hiện sản phẩm PCR bằng phƣơng pháp điện di trên thạch agarose.
- Phản ứng đƣợc thực hiện với mẫu tế bào đìch của từng loại vi khuẩn khác nhau nhƣng gây bệnh cảnh lâm sàng viêm màng não mủ giống S. suis hoặc có đặc điểm cấu tạo giống S. suis và của bạch cầu ngƣời để kiểm tra sự không bắt cặp chéo (đánh giá tình đặc hiệu của các cặp mồi sử dụng phát hiện vi khuẩn và đặc tình vi khuẩn S. suis).
2.2.7. Xây dựng quy trình xử lý bệnh phẩm để tách chiết DNA của S. suis
Từ huyền dịch vi khuẩn S. suis thuần khiết đã đƣợc chuẩn độ ở trên, chúng tôi nghiên cứu các phƣơng pháp tách chiết đơn giản DNA của vi khuẩn trực tiếp trong bệnh phẩm và đánh giá hiệu quả tách chiết DNA của S. suis bằng thực nghiệm phát hiện bởi PCR đa mồi đƣợc xây dựng dành cho vi khuẩn S. suis nhƣ sau:
2.2.7.1. Xử lý bệnh phẩm bằng nhiệt độ có kết hợp enzyme (hỗ trợ phá vỡ tế bào):
Trộn đều mẫu bệnh phẩm (mô hính là „DNT + vi khuẩn đã chuẩn độ‟):
- Lấy 100µl vào ống Eppendorf + lysozym (nồng độ cuối 2mg/ml), ủ ở các thời gian nhƣ sau: ủ 370C/15‟; ủ 370C/30‟. Sau đó xử lý tiếp ở các nhiệt độ sau đây: 560C/30‟; 1000C/10‟.
Đặng Thị Kiều Oanh 49 Cao học K18 - Lấy 100µl vào ống Eppendorf + Mutanolysin (nồng độ cuối 1mg/ml), ủ ở các thời gian sau: ủ 370
C/15‟; ủ 370C/30‟. Sau đó xử lý tiếp ở các nhiệt độ sau đây: 560C/30‟; 1000C/10‟.
2.2.7.2. Xử lý bệnh phẩm bằng nhiệt đơn thuần (đơn giản hơn): chọn nhiệt độ, chọn thời gian xử lý nhiệt.
- Trộn đều mẫu bệnh phẩm (mô hính là „DNT + vi khuẩn đã chuẩn độ‟), lấy 500µl vào ống Eppendorf → ly tâm 15.000 vòng/10 phút, giữ lại 100 µl cặn +5µl Triton x 100.
- Xử lý nhiệt ở các loại nhiệt độ nhƣ sau: 1000C/10phút; 1000C/15 phút; 1000C/20 phút; 1000C/35 phút; 900
C/30‟; 900C/60‟; 850C/35 phút; 850C/60 phút; 800C/35phút; 800C/60phút; 800C/75phút; 800C/90phút.
Khi đã chọn đƣợc chế độ nhiệt độ, thời gian thìch hợp để tách DNA đìch trực tiếp trong bệnh phẩm: làm lạnh sản phẩm ở 40C, sử dụng 1- 2 µl cho phản ứng PCR
Sản phẩm của các quy trính xử lý đơn giản ở trên sẽ đƣợc so sánh với sản phẩm xử lý bằng bộ sinh phẩm (kit) của Roche “High pure PCR product Purification” có thêm xúc tác của enzym thìch hợp nhất với vi khuẩn Gram dƣơng (mutanolysin) thông qua kết quả phát hiện của PCR đa mồi hoàn thiện.
2.2.8. Áp dụng toàn bộ các quy trình đã xây dựng (xử lý bệnh phẩm, PCR đa mồi) để phát hiện vi khuẩn S. suis trực tiếp từ bệnh phẩm lâm sàng.
- Sử dụng mẫu bệnh phẩm dịch não tủy từ bệnh nhân có triệu chứng lâm sàng nghi viêm màng não mủ do vi khuẩn S. suis để đánh giá tình hiệu quả của kỹ thuật xử lý đơn giản và quy trính PCR đa mồi. Số lƣợng mẫu bệnh phẩm tùy thuộc điều kiện thực tế thu đƣợc trong thời gian nghiên cứu, cụ thể ở nghiên cứu (NC) này là 53 mẫu bệnh phẩm thu đƣợc từ ngƣời mắc bệnh nghi do S. suis
- So sánh kết quả phát hiện bằng PCR đa mồi với kết quả phát hiện bằng nuôi cấy phân lập và bằng PCR đơn mồi.
- Phân tìch các giá trị dƣơng tình thực và âm tình thực của phƣơng pháp PCR đa mồi.
Đặng Thị Kiều Oanh 50 Cao học K18
2.3. ĐÁNH GIÁ CÁC GIÁ TRỊ HỮU ÍCH CỦA PHƢƠNG PHÁP
2.3.1. Tiêu chuẩn xác định chẩn đoán dƣơng tính và âm tính
Tiêu chuẩn chẩn đoán viêm màng não nghi do vi khuẩn liên cầu khuẩn lợn (S. suis):
- Lâm sàng: có các dấu hiệu nhiễm trùng hệ thần kinh trung ƣơng – viêm màng não (sốt, đau đầu, buồn nôn, nôn, cứng gáy, lơ mơ, hôn mê, bầm tìm, ban đỏ…).
- Có tiền sử dịch tễ liên quan đến lợn/sản phẩm sống của lợn (giết mổ, bán, ăn tiết canh..)
Tiêu chuẩn chẩn đoán xác định viêm màng não do vi khuẩn liên cầu khuẩn lợn (S. suis) nhằm mục đích phân tích so sánh kết quả của phương pháp nuôi cấy phân lập và phương pháp PCR đa mồi như sau:
- Lâm sàng: có dấu hiệu viêm màng não nói chung
- Có tiền sử dịch tễ liên quan đến lợn ốm/sản phẩm sống của lợn hoặc nghề nghiệp liên quan đến lợn/sản phẩm sống của lợn.
- Xác định đƣợc tác nhân gây bệnh bởi một trong hai phƣơng pháp hoặc bằng nuôi cấy phân lập hoặc bằng việc phát hiện đƣợc gen đặc hiệu của vi khuẩn bởi kỹ thuật PCR (đơn mồi hay đa mồi)
Viêm màng não không do vi khuẩn liên cầu khuẩn lợn (S. suis):
Mẫu âm tình do không phải vi khuẩn liên cầu khuẩn lợn khi cấy bệnh phẩm không có S. suis và/hoặc không phát hiện đƣợc vật liệu di truyền của vi khuẩn bởi PCR.
Chú ý:
Tiêu chuẩn trên được sử dụng trong trường hợp phân tích, so sánh kết quả của phương pháp nuôi cấy và PCR đa mồi (phương pháp thử nghiệm).
Kết quả của PCR đa mồi cũng đƣợc so sánh với kết quả phát hiện của PCR đơn mồi (đƣợc tiến hành trên cùng 1 mẫu bệnh phẩm).
2.3.2. Các chỉ số tính toán độ tin cậy và giá trị của phƣơng pháp [3, 4]
Các chỉ số gồm: độ nhậy (Se), độ đặc hiệu (Sp), tỷ lệ dƣơng tính giả, tỷ lệ âm tính giả, giá trị tiên đoán dƣơng tính (PPV), giá trị tiên đoán âm tình (NPV), tỷ
Đặng Thị Kiều Oanh 51 Cao học K18
số dự báo khả năng mắc bệnh khi xét nghiệm dƣơng tình (LR+), tỷ số dự báo khả năng không mắc bệnh khi xét nghiệm âm tình (LR–).
Bảng 2.3. Bảng số liệu cơ bản để tính toán các chỉ số
Phƣơng pháp đã công bố Tổng Dƣơng tình Âm tình Phƣơng pháp thử nghiệm Dƣơng tình a b a+b Âm tình c d c+d Tổng a+c b+d a+b+c+d
Độ nhạy hay tỷ lệ dƣơng tình thật = a/(a+c) Độ đặc hiệu hay tỷ lệ âm tình thật = d/(b+d) Tỷ lệ dƣơng tình giả = b/(b+d) Tỷ lệ âm tình giả = c/(a+c)
Tỷ số dƣơng khả dĩ - Tỷ số dự báo khả năng bệnh khi xét nghiệm dƣơng tình (LR+) LR+ = Độ nhạy/ (1- độ đặc hiệu)
Tỷ số âm khả dĩ - Tỷ số dự báo không mắc bệnh khi xét nghiệm âm tình (LR
̶
) LR- = (1- độ nhạy)/ độ đặc hiệu
Giá trị dự đoán dƣơng tình (PPV) = a/ (a+b) Giá trị dự đoán âm tình (NPV) = d/ (c+d)
Bảng 2.4. Mức độ LR+
, LR - liên quan đến khả năng mắc bệnh và không mắc bệnh
Mức độ LR+
Khả năng mắc bệnh . Mức độ LR- Khả năng không mắc bệnh
10 Cao 0.1 Cao
5-10 Trung bính 0.1-0.2 Trung bính
Đặng Thị Kiều Oanh 52 Cao học K18
2 Rất thấp 0.5 Rất thấp
Đặng Thị Kiều Oanh 53 Cao học K18
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. XÂY DỰNG QUY TRÌNH PCR ĐA MỒI PHÁT HIỆN TRỰC TIẾP
Streptococcus suis VÀ MỘT SỐ ĐỘC LỰC PHỔ BIẾN CỦA VI KHUẨN
3.1.1. Tạo bệnh phẩm mô phỏng
Bảng 3.1. Kết quả khẳng định lại đặc tính của vi khuẩn dùng làm mẫu
TT Phƣơng pháp thử nghiệm Kết quả thử nghiệm
1 Tình chất bắt màu Gram Gram (+)
2 Phản ứng catalase Âm tình
3 Xác định nhóm kháng nguyên theo Lancefield Nhóm D
4 Xác định tình chất sinh học Typ huyết thanh 2
Để khẳng định lại các đặc tình của chủng vi khuẩn đƣợc sử dụng để tạo mẫu bệnh phẩm mô phỏng, nhóm nghiên cứu đã tiến hành thử nghiệm các đặc tình của chủng vi khuẩn nhƣ trong bảng 3.1 bao gồm tình chất bắt màu Gram, phản ứng catalase, nhóm kháng nguyên và định týp huyết thanh. Kết quả cho thấy chủng vi khuẩn đáp ứng đúng các đặc tình của týp huyết thanh 2 của vi khuẩn
Streptococcus suis.
Từ vi khuẩn S. Suis đã đƣợc khẳng định lại, nhóm nghiên cứu đã tạo đƣợc các huyền dịch vi khuẩn có nồng độ từ 107 vk/ µl đến 1vk/ µl và bộ bệnh phẩm DNA tinh khiết có nồng độ từ 107copy/ µl đến 1 copy/µl.
Đặng Thị Kiều Oanh 54 Cao học K18
3.1.2. Lựa chọn các cặp mồi và tổ hợp mồi phù hợp:
Hình 3.1. Thử nghiệm các tổ hợp mồi phù hợp (từ tổ hợp 1 đến tổ hợp 8)
M: thang chuẩn DNA cỡ 100bp; TH: Tổ hợp mồi
Ở tất cả các tổ hợp mồi, các băng DNA đều hiện rõ ở vị trì 498 bp (tƣơng ứng với sản phẩm của cặp mồi Cps2J, đặc hiệu cho týp huyết thanh 2), và vị trì 248 bp (tƣơng ứng với sản phẩm của cặp mồi đặc hiệu cho enzym ly giải tế bào sly. Nhƣ vậy hai cặp mồi Cps2J và Sly đều hoạt động rất tốt trong cả 8 tổ hợp. Đối với các tổ hợp mồi từ 1 đến 4, các vạch DNA là sản phẩm của mồi đặc hiệu cho S.suis 16S rDNA đều biểu hiện tốt.Tuy nhiên ở TH3 và TH4, cả 2 sản phẩm của cặp mồi Mrp có kìch thƣớc 188 bp đều không biểu hiện. Tất cả các tổ hợp từ 5 đến 8, sản phẩm của 2 cặp mồi Gdh và Cps2J biểu hiện không rõ ràng. Chỉ có TH1 và TH2, sản