Tạo huyền dịch vi khuẩn thuần nhất, chuẩn bị DNA của vi khuẩn S. suis làm chứng dƣơng và tạo mô hính thử nghiệm.
2.2.1.1. Khẳng định các đặc tính của vi khuẩn tạo mẫu: Cấy mới
Cấy từ ống giữ chủng (cất ở -800C) lên môi trƣờng thạch máu 5%, ủ qua đêm ở 370C/5%CO2. Nhận xét hính thái khuẩn lạc, tình gây tan huyết.
Tính chất bắt màu Gram
Nhuộm Gram đƣợc thực hiện nhƣ sau:
- Làm sạch phiến kình bằng lau cồn và hơ qua lửa đèn cồn, để nguội;
Đặng Thị Kiều Oanh 39 Cao học K18 - Lấy 1 khuẩn lạc, hòa đều khuẩn lạc vào trong giọt PBS (hoặc nƣớc muối sinh lý), dùng que cấy dàn rộng và để khô tự nhiên;
Chú ý: các bước này thực hiện trong tủ an toàn sinh học
- Cố định tế bào vi khuẩn trên phiến kình bằng hơ qua trên lửa đèn cồn hoặc bằng methanol;
- Phủ 1 giọt thuốc nhuộm Crystal Violet lên phần tiêu bản vi khuẩn, ngâm trong vòng 1 phút, rửa nƣớc;
- Phủ 1 giọt „Stabilized Gram Iodine‟ hoặc dung dịch 2% Iodide lên phần tiêu bản vi khuẩn, ngâm trong vòng 1 phút, rửa nƣớc;
- Để tẩy màu, ngâm tiêu bản vào dung dịch „Gram Decolorizer‟ (250ml Acetone + 750ml Isopropanol) hoặc dung dịch Acetone/Ethanol (50%/50%), sau đó rửa phiến kình bằng nƣớc máy;
- Phủ tiếp 1 giọt dung dịch „Gram Safranin Counterstain‟ hoặc dung dịch 0.1% Fucsin lên phần tiêu bản vi khuẩn, ngâm trong vòng 1 phút, rửa nƣớc;
- Tiêu bản đƣợc để khô tự nhiên. Trƣớc khi soi đặt một lá kình lên phần tiêu bản đã nhuộm và soi dƣới kinh hiển vi quang học có vật kình 100x .
Phản ứng catalase:
- Pha dung dịch 3% H2O2 với nƣớc cất trƣớc khi thực hiện phản ứng;
- Dùng que cấy lấy 1 khuẩn lạc vi khuẩn (thƣờng lấy ở tâm khuẩn lạc) đặt lên phiến kình. Không lấy lẫn thạch máu vào mẫu vi khuẩn;
- Nhỏ 1 giọt dung dịch H2O2 3% vào vùng có khuẩn lạc trên phiến kình;
- Quan sát sự nổi bong bóng (sinh khì);
Lưu ý: toàn bộ quá trình thử nghiệm phải được thực hiện trong tủ an toàn sinh học
Xác định nhóm kháng nguyên theo Lancefield
- Cấy mới chủng vi khuẩn cần thử trên thạch máu cừu, ủ qua đêm ở 35-37oC có hoặc không có CO2;
Đặng Thị Kiều Oanh 40 Cao học K18 - Pha enzym tách chiết (extraction enzyme solution): trộn 11ml nƣớc tinh khiết vào lọ enzym (Streptex), hoà tan. Dung dịch enzym này có thể giữ ở 2-8oC trong 3 tháng. Muốn giữ lâu hơn, chia nhỏ thể tìch và giữ ở -200C;
- Thực hiện phản ứng ngƣng kết tiếp theo trong tủ an toàn sinh học:
+ Nhỏ 1400 µl dung dịch enzym tách chiết (Extraction Enzyme solution) vào ống Epp đã đánh dấu (dung lƣợng 1,5ml). Hoà chủng vi khuẩn cần thử nghiệm vào dung dịch enzyme này (khoảng 5 khuẩn lạc to);
+ Ủ huyền dịch vi khuẩn/enzym ở 35- 37℃ trong 1 giờ;
+ Ly tâm ở 13000-15000 rpm trong 30‟‟(sec). Dịch nổi đƣợc thu hồi cho phản ứng ngƣng kết với kháng huyết thanh xác định nhóm (dạng ngƣng kết latex);
+ Trộn kỹ các lọ thuốc thử latex bằng vortex. Nhỏ 01 giọt (khoảng 20µl của mỗi loại huyền dịch latex (Streptex) lên vòng tròn của tấm thẻ phản ứng;
+ Đặt 1 giọt (khoảng 10 µl huyền dịch vi khuẩn (sau bƣớc 3) vào thẻ phản ứng. Trộn đều và dàn rộng để quan sát hiện tƣợng ngƣng kết.
+ Xoay tấm thẻ lên xuống và quan sát phản ứng ngƣng kết bằng mắt thƣờng;
+ Ghi nhận kết quả: chủng S. suis đƣợc thử thuộc nhóm D.
Xác định tính chất sinh học
- Vi khuẩn S. suis đƣợc xác định tình chất sinh học bằng bộ API 20 Strep (BioMérieux);
- Tạo huyền dịch vi khuẩn có độ đục tƣơng đƣơng 1Mc Farland với nƣớc muối sinh lý;
- Nhỏ lên lam kình sạch 15µl kháng huyết thanh kháng S. suis typ 2;
- Nhỏ 15 µl nƣớc muối sinh lý lên 1 vị trì khác trên lam kình;
- Nhỏ vào mỗi vi trì trên 15µl huyền dịch vi khuẩn;
- Trộn đều bằng tăm gỗ, quan sát sự ngƣng kết trong vòng 1 phút:
+ Phản ứng (+): xuất hiện các hạt nhỏ và hỗn dịch trở nên trong ở vị trì có kháng huyết thanh; vẫn đục đều ở vị trì có nƣớc muối sinh lý;
Đặng Thị Kiều Oanh 41 Cao học K18
2.2.1.2. Nghiên cứu tạo mô hình bệnh phẩm với vi khuẩn S. suis:
- Chọn 10 mẫu DNT của những bệnh nhân viêm não vi rút hoặc hội chứng não cấp (đƣợc khẳng định không phải viêm màng não do vi khuẩn), hỗn hợp lại (đây là dịch não tủy nền)
- Gặt vi khuẩn S. suis (đã đƣợc cấy mới và kiểm tra ở trên) từ môi trƣờng thạch máu 5% pha vào 1ml hỗn hợp dịch não tủy đã chuẩn bị ở trên.
- Điều chỉnh độ đục ngang với thang chuẩn 0,5 Mc Farland.Tình lại số vi khuẩn/ml (ví theo quy định của bộ so độ đục Mc Farland thí 1,5 x 108 tƣơng đƣơng độ đục 0,5 Mc Farland, thực tế đối với vi khuẩn S. suis sẽ là bao nhiêu ở độ đục 0,5 Mc Farland?) bằng cách pha loãng tiếp bậc 10, lấy 1ml ở nồng độ pha loãng thấp nhất (thƣờng tƣơng đƣơng 102/ml) láng đều lên đĩa thạch máu 5%, Ủ qua đêm và đếm số khuẩn lạc. Kết quả cho thấy số lƣợng vi khuẩn S. suis tƣơng đƣơng là 1,21 x 107 vk/ µl
- Từ canh khuẩn có độ đục 0,5 Mc Farland, sẽ thực hiện 2 việc:
+ Chia nhỏ thể tìch huyền dịch vi khuẩn vào các ống Eppendorf (0,1ml/1ống): để thực hiện mục đìch“Xây dựng phƣơng pháp xử lý dịch não tủy đơn giản không dùng kit và đảm bảo hiệu quả”
Pha các nồng độ vi khuẩn hơn kém nhau 10 lần như sau:
Hỗn dịch vi khuẩn có độ đục 0,5 Mc Farland có lƣợng vi khuẩn tƣơng đƣơng 107 vk/µl (1). Để có nồng độ 106vk/ µl: 10 µl của (1) + 90 µl DNT (2) Để có nồng độ 105 vk/ µl: lấy 10 µl của (2) + 90 µl DNT (3) Để có nồng độ 104 vk/ µl: lấy 10 µl của (3) + 90 µl DNT (4) Để có nồng độ 103vk/ µl: lấy 10 µl của (4) + 90 µl DNT (5) Để có nồng độ 102vk/ µl: lấy 10 µl của (5) + 90 µl DNT (6) Để có nồng độ 10vk/ µl: lấy 10 µl của (6) + 90 µl DNT (7) Để có nồng độ 1vk/ µl: lấy 10 µl của (7) + 90 µl DNT (8) Để có nồng độ 5 vk/ µl: lấy 10 µl của (7) + 10 µl DNT (9) Để có nồng độ 2 vk/ µl: lấy 10 µl của (7) + 40 µl DNT (10)
Đặng Thị Kiều Oanh 42 Cao học K18 Những nồng độ vi khuẩn còn nguyên vẹn này được sử dụng để nghiên cứu xây dựng, tối ưu quy trình PCR đa mồi và kỹ thuật tách chiết DNA đơn giản bằng nhiệt độ, không sử dụng kit tách chiết (là thương phẩm) và đánh giá kết quả phát hiện trực tiếp vi khuẩn từ DNT bằng PCR.
+ Sử dụng 0,5ml hỗn dịch để tách DNA bằng bộ sinh phẩm „High Pure PCR product purification‟ và enzyme mutanolysin. Sau đó đo lƣợng DNA thu đƣợc bằng máy đo “DNA Nano drop” và pha thành các nồng độ nhỏ hơn nhau 10 lần (pha loãng bậc 10) với dịch não tủy nền: loạt nồng độ này sử dụng để xác định giới hạn phát hiện (độ nhạy) của quy trính PCR đa mồi.
Chi tiết của bước ‘Tách chiết và tinh sạch DNA của vi khuẩn S. suis – đo nồng độ DNA':
- Từ chủng vi khuẩn S. suis gây bệnh đã qua các bƣớc kiểm tra chất lƣợng ở trên đƣợc cấy mới trên môi trƣờng thạch máu 5%.
- Chuẩn độ vi khuẩn theo độ đục 0,5 Mc Farland (trong DNT).
- Lấy 0,5ml hỗn dịch vi khuẩn có độ đục trên, ly tâm 14.500 vòng/15 phút, lấy cặn bỏ dịch nổi.
- Ủ cặn với 90µl đệm Tris (10mM, pH 8,0) và 10 µl Mutanolysin (1mg/ml) ở 370C/20 phút.
- Sau đó thực hiện theo hƣớng dẫn của Nhà sản xuất Roche “High Pure PCR product purification Kit” (Roche Diagnostics, Cat. 11732676001).
- Trộn 500 µl Binding Buffer với hỗn dịch (4), đặt hỗn hợp vào ống lọc (Filter) đƣợc hứng phìa dƣới bởi 1 ống dung tìch 2ml, ly tâm 14500 x 45 sec (yêu cầu 15000 vòng x 30sec) ở máy ly tâm Mini plus.
- Chuyển ống Filter sang ống 2ml mới, cho tiếp 500 µl Washing Buffer vào Filter (loại bỏ ống cũ đã chứa dịch ly tâm), ly tâm 14500 vòng x 45 sec (yêu cầu 15000 vòng x 30sec) ở máy ly tâm Mini plus.
- Chuyển ống Filter sang ống 2ml mới, cho tiếp 200 µl Washing Buffer vào Filter (loại bỏ ống cũ đã chứa dịch ly tâm), ly tâm 14500 vòng x 45 sec (yêu cầu 15000 vòng x 30sec) ở máy ly tâm Mini plus.
Đặng Thị Kiều Oanh 43 Cao học K18 - Chuyển ống Filter sang ống Eppendorf 1,5ml mới, viết tên/mã số bệnh phẩm lên nắp (loại bỏ ống cũ đã chứa dịch ly tâm), cho 50 µl Tris buffer (10mM, pH 8.0) vào ống Filter, đóng chặt nắp và đặt cả bộ vào máy Ủ NHIỆT 700C/10 phút. Sau khi “ủ nhiệt” ly tâm 14500 vòng x 45 sec (yêu cầu 15000 vòng x 30sec) ở máy ly tâm Mini plus.
- Loại bỏ ống Filter, giữ lại ống Epp đã chứa dịch đƣợc đẩy xuống (đó là DNA đã đƣợc tách chiết & tinh sạch). Bảo quản ở - 200C và sử dụng 0,5 - 1 µl làm khuôn đìch DNA
- Đo nồng độ DNA đã tinh sạch bằng máy quang phổ đo DNA. Tình số lƣợng vi khuẩn dựa trên trọng lƣợng phân tử (DNA) của vi khuẩn.
Cách tính: hàm lƣợng DNA của vi khuẩn trong huyền dịch vi khuẩn thuần nhất sau khi tách chiết bằng Kit (bộ sinh phẩm thƣơng mại):
46.71 µg/ml (= 4,67 x 10-8g/µl). Kìch thƣớc bộ gen của S. suis là: 2Mb = 2 x 106 (bp) Trọng lƣợng phân tử là: 2 x 106 x 660 = 1,32 x 109 dalton
Ví vậy, số copy (hay số vi khuẩn) trong 1µl của huyền dịch tạo đƣợc là: (4,67 x 10-8 x 6,023 x 1023 ) x 1
--- = 2,13 x 107 copy/µl (1) 1,32 x 109
+ Để có nồng độ 106
copy / µl: lấy 10 µl của (1) + 90 µl DNT (2)
+ Để có nồng độ 105 copy / µl: lấy 10 µl của (2) + 90 µl DNT (3)
+ Để có nồng độ 104 copy / µl: lấy 10 µl của (3) + 90 µl DNT (4)
+ Để có nồng độ 103 copy / µl: lấy 10 µl của (4) + 90 µl DNT (5)
+ Để có nồng độ 102 copy /µl: lấy 10 µl của (5) + 90 µl DNT (6)
+ Để có nồng độ 101 copy / µl: lấy 10 µl của (6) + 90 µl DNT (7)
+ Để có nồng độ 100(1 copy)/µl: lấy 10 µl của (7) + 90 µl DNT (8)
+ Để có nồng độ 5 copy/µl: lấy 10 µl của (7) + 10 µl DNT (9)
+ Để có nồng độ 2 copy /µl: lấy 10 µl của (7) + 40 µl DNT (10)
Những nồng độ DNA này được sử dụng trong thực nghiệm đánh giá hiệu quả phát hiện của PCR đa mồi:
Đặng Thị Kiều Oanh 44 Cao học K18