PCR là một phản ứng dây chuyền: Phân tử DNA đƣợc sử dụng để tạo ra 2, 4, 8… bản sao. Sự nhân lên liên tục của DNA đƣợc thực hiện bởi các protein cụ thể là polymerase, enzyme này có khả năng tổng hợp các chuỗi DNA từ các nucleotit. Để
Đặng Thị Kiều Oanh 25 Cao học K18
thực hiện tổng hợp DNA cần có 4 loại nucleotit là adenine (A), thymine (T), cytosine (C) và guanine (G). PCR là một phƣơng pháp đƣợc sử dụng để tạo ra nhiều bản sao của bất kỳ sợi axit nucleic nào. Đây là một phƣơng pháp khuếch đại một cách chọn lọc một đoạn DNA của hệ gen. Trong quy trính PCR gốc của Mullis, DNA sợi kép đƣợc tách thành hai sợi đơn của DNA bằng cách nung nóng nó đến 96 ° C. Tuy nhiên, ở nhiệt độ này, DNA polymerase của E.Coli bị phá hủy, cần phải bổ sung các enzyme mới sau giai đoạn nung nóng của mỗi chu kỳ. Quy trính PCR này không hiệu quả ví nó đòi hỏi nhiều thời gian, số lƣợng DNA polymerase lớn, và sự theo dõi liên tục trong suốt quá trính PCR [40].
Hình 1.4. Sơ đồ phản ứng PCR
(http://fmel.ifas.ufl.edu/buzz/csPCR.shtml)
Các bước trong phản ứng PCR
Có ba bƣớc chình liên quan đến PCR kỹ thuật: biến tình, ủ, và kéo dài chuỗi. Trong bƣớc biến tình, DNA bị biến tình ở nhiệt độ cao (từ 90 – 97 oC). Trong bƣớc hai, mồi bám vào DNA sợi khuôn để kéo dài chuỗi. Trong bƣớc thứ ba, quá trính
Đặng Thị Kiều Oanh 26 Cao học K18
kéo dài chuỗi xảy ra ở phần cuối của giai đoạn ủ mồi để tạo ra một bản sao của sợi DNA. Để khuếch đại một đoạn của DNA bằng PCR, DNA khuôn đƣợc làm nóng để chúng biến tình và tách thành 2 chuỗi DNA sợi đơn. Tiếp theo, một loại enzyme đƣợc gọi là "Taq polymerase" sẽ chịu trách nhiệm tổng hợp hai sợi DNA mới bằng cách sử dụng sợi DNA gốc làm khuôn. Sau quá trính sao chép sẽ tạo hai phân tử DNA mới có 1 sợi khuôn và 1 sợi mới tổng hợp. 7. Giai đoạn ủ xảy ra ở nhiệt độ thấp, 50-60 ° C. Điều này cho phép các mồi bắt cặp với các đoạn bổ sung tƣơng ứng trên DNA khuôn. Taq polymerase thêm nucleotide có sẵn để kết thúc ủ mồi. Việc kéo dài chuỗi bằng Taq polymerase xảy ra ở khoảng 72 ° C trong 2-5 phút. DNA polymerase I không thể đƣợc sử dụng để kéo dài chuỗi bởi ví nó không ổn định ở nhiệt độ cao đƣợc sử dụng cho phản ứng PCR. Ƣu điểm của chu kỳ và quy trính PCR là nó rất nhanh so với các kỹ thuật khác và mỗi chu kỳ làm tăng gấp đôi số lƣợng các bản sao của sợi DNA mong muốn. Sau 25-30 chu kỳ, sản phẩm PCR sẽ chứa rất nhiều bản sao của mẫu DNA ban đầu để tiến hành thử nghiệm. Nếu sử dụng thời gian tối đa cho mỗi bƣớc, 30 chu kỳ sẽ chỉ mất 6 giờ để hoàn thành. Khi quá trính biến tình, ủ và kéo dài chuỗi đƣợc tiếp tục mồi liên tục bắt cặp với cả hai gốc DNA mẫu và bổ sung các nucleotit và tổng hợp nên sợi DNA mới. Cuối cùng, kết quả là số lƣợng bản sao của DNA đƣợc gia tăng theo cấp số nhân. Một DNA polymerase chịu nhiệt đã đƣợc đƣa vào sử dụng trong quy trính PCR đó là enzyme Taq DNA polymerase.DNA polymerase này đƣợc phân lập từ Thermus aquaticus
(Taq) phát triển trong các mạch nƣớc phun có nhiệt độ hơn 110 ° C, và đã đóng góp rất nhiều vào việc tăng năng suất, tình đặc trƣng, tự động hóa, và tiện ìch của phản ứng PCR. Sau chu kỳ cuối cùng, mẫu thƣờng đƣợc ủ ở 72 ° C trong 5 phút để các sản phẩm PCR đƣợc tổng hợp một cách hoàn thiện. Để đảm bảo thành công, cần phải thực hiện tốt cả hai giai đoạn là giai đoạn chuẩn bị hỗn hợp phản ứng và thiết lập các điều kiện của phản ứng.
Điện di: sản phẩm của đoạn DNA khuyếch đại đƣợc điện di trên thạch agarose. Tùy theo kìch thƣớc của DNA mà sử dụng loại gel agarose đơn hay phối hợp và điện trƣờng khác nhau.
Đặng Thị Kiều Oanh 27 Cao học K18
Đọc kết quả: Dựa vào DNA mẫu trên nền đèn cực tìm, xác định sản phẩm khuyếch đại tƣơng ứng với kìch thƣớc của DNA đó.
Ứng dụng của phản ứng PCR
PCR đƣợc ứng dụng nhiều trong việc điều tra và chẩn đoán của nhiều loại bệnh khác nhau. Nó là phƣơng pháp tiêu chuẩn trong tất cả các phòng thì nghiệm thực hiện nghiên cứu với axit nucleic. Ngay cả một số kỹ thuật khác đƣợc sử dụng cũng đòi hỏi việc khuếch đại DNA là một bƣớc cần thiết trong quy trính thực hiện. Phản ứng PCR đã đƣợc rất nhiều nhà khoa học trong những lĩnh vực nghiên cứu khác nhau. Việc sử dụng sao chép ngƣợc để đánh giá RNA (RT-PCR) và phƣơng pháp PCR định lƣợng (Realtime PCR) là những tiến bộ lớn phát triển từ kỹ thuật PCR. Phƣơng pháp PCR cho phép xác định sự thay đổi trong biểu hiện gen đã cung cấp cho các nhà khoa học sự hiểu biết sâu sắc về quá trính mắc bệnh và tạo cơ sở cho chẩn đoán và nghiên cứu khoa học cơ bản. Trong vi sinh học và sinh học phân tử, PCR đƣợc sử dụng trong nghiên cứu nhân dòng DNA, phƣơng pháp lai DNA Southern Blotte, giải trính tự DNA và công nghệ DNA tái tổ hợp. Trong vi sinh học lâm sàng, PCR đóng vai trò quan trọng trong chẩn đoán nhiễm vi sinh và nghiên cứu dịch tễ học. PCR cũng đƣợc sử dụng trong các phòng thì nghiệm pháp y và đặc biệt hữu ìch ví chỉ cần một lƣợng rất nhỏ DNA đìch, vì dụ chỉ cần 1 giọt máu hoặc 1 cái tóc cũng có thể cung cấp đủ lƣợng DNA cần thiết. Trong thực tế, một số thử nghiệm bằng cách sử dụng PCR để phát hiện một loạt các vi khuẩn trong mẫu dịch não tủy đã đƣợc báo cáo. Kể từ khi quá trính nuôi cấy C. pneumoniae gặp khó khăn trong hầu hết các phòng thì nghiệm lâm sàng, phƣơng pháp PCR đã đƣợc sử dụng để xác định vi khuẩn này trong các mẫu lâm sàng. Nested PCR là một trong những quy trính để phát hiện một vài vi khuẩn trong các mẫu lâm sàng. PCR định tình có thể đƣợc sử dụng để phát hiện không chỉ các gen của ngƣời mà còn phát hiện gen của vi khuẩn và vi rút. Một trong những ứng dụng y tế ứng dụng quan trọng nhất của PCR là phát hiện tác nhân gây bệnh. Nhiều vi rút chứa RNA hơn là DNA. Ví thế, RT-PCR đƣợc sử dụng để phát hiện các RNA của những loại vi rút này. Phƣơng pháp PCR có thể phát hiện DNA của vi sinh vật trong bất kỳ mẫu nào, cho
Đặng Thị Kiều Oanh 28 Cao học K18
dù là dịch của cơ thể, thực phẩm hoặc nƣớc uống. Phƣơng pháp PCR định lƣợng cung cấp thông tin bổ sung ngoài việc đơn thuần phát hiện DNA. Phƣơng pháp này không chỉ cho biết sự có mặt của 1 đoạn DNA cụ thể trong mẫu mà còn cho biết số lƣợng của đoạn DNA đó là bao nhiêu. Một ứng dụng quan trọng của PCR định lƣợng là trong chẩn đoán phân tử, nghĩa là việc chẩn đoán bệnh dựa trên những phát hiện phân tử chứ không phải là trên các triệu chứng sinh lý. PCR là xét nghiệm nhạy nhất với vi rút herpes simplex, vi rút varicella-zoster, và human papillomavirus. Chẩn đoán khác sử dụng bao gồm cả xét nghiệm các bệnh di truyền, bệnh ung thƣ, và các bệnh truyền nhiễm khác. Một ứng dụng quan trọng khác của phƣơng pháp PCR định lƣợng đó là xét nghiệm HIV. Nó có thể phát hiện vi rút HIV sớm hơn trong vài tuần đầu sau khi nhiễm bệnh, nhạy hơn phƣơng pháp ELISA [40].
Cả PCR định tình và định lƣợng đóng một vai trò quan trọng trong việc chiến đấu chống lại căn bệnh ung thƣ. PCR có thể xác định gen liên quan trong sự phát triển của ung thƣ. Có rất nhiều các ứng dụng PCR định lƣợng trong phòng thì nghiệm. Nó thƣờng đƣợc sử dụng cho cả hai mục đìch nghiên cứu cơ bản và đƣợc triển khai nhƣ một công cụ để mới phát hiện bệnh mới nổi. Kỹ thuật PCR có nhiều ứng dụng tiềm năng, bao gồm cả phát hiện và định lƣợng các tác nhân gây bệnh có mật độ thấp, các trính tự di truyền hiếm gặp, và gen biểu hiện trong tế bào đơn lẻ [40].