1.5.3.1. Giới thiệu chung
PCR đa mồi là một loại phản ứng khuếch đại gen nhƣng không phải chỉ khuếch đại một trính tự gen đìch mà có thể cùng một lúc khuếch đại hai hay nhiều hơn hai trính tự gen đìch khác nhau khi sử dụng hai hay nhiều loại mồi khác nhau (primers) với cùng một quy trính khuếch đại trong cùng một ống phản ứng. Do đó, sử dụng PCR đa mồi có thể tiết kiệm đƣợc thời gian, công sức xét nghiệm và có khả năng phát hiện đƣợc hai hay nhiều tác nhân gây bệnh trong cùng một lúc.
Đặng Thị Kiều Oanh 29 Cao học K18
Phân tìch đƣợc các sản phẩm khuếch đại (sản phẩm PCR) của mỗi một cá thể (hay một tác nhân gây bệnh) từ hỗn hợp các sản phẩm PCR đã làm cho phƣơng pháp PCR đa mồi trở thành một phƣơng pháp sàng lọc nhanh chóng, tiện lợi cho cả lâm sàng và nghiên cứu.
Trong lĩnh vực các bệnh nhiễm trùng, PCR đa mồi là công cụ có giá trị trong việc định danh vi rút, vi khuẩn và ký sinh trùng.
1.5.3.2. Tối ưu hóa các thành phần phản ứng PCR đa mồi Tối ưu hóa các thành phần phản ứng PCR đa mồi
Để có đƣợc hiệu quả cao nhất khi sử dụng PCR đa mồi trong phát hiện gen đìch ngƣời ta phải chú ý nhiều hơn tới mọi khìa cạnh của kỹ thuật PCR nhƣ mồi (vị trì, trính tự, hàm lƣợng, nhiệt độ bắt cặp); hàm lƣợng Taq polymerase; nồng độ MgCl2; sự tƣơng quan giữa các thành phần phản ứng và gen đìch… thêm nữa là các loại thạch điện di và nồng độ thạch phối hợp.
Một trong những khái niệm quan trọng nhất của PCR là sự phù hợp tối ƣu của tỷ lệ mồi (primer) và „khuôn‟ (DNA của tế bào đìch hay „template‟). Nếu tỷ lệ này quá cao, sản phẩm trùng hợp mồi đƣợc hính thành, nhƣ vẫn xảy ra khi ta pha rất loãng „khuôn‟ hoặc cho dƣ thừa mồi. Mồi luôn phải ở trong mức dƣ thừa 107
phân tử đối với khuôn. Trong hầu hết các áp dụng, không kể đến nồng độ của khuôn, nồng độ mồi không đƣợc tăng vƣợt quá 0,5µM ví sản phẩm trùng hợp mồi sẽ đƣợc tạo nên. Tỷ lệ mồi – khuôn quá thấp, sản phẩm sẽ không đƣợc tăng lên theo số mũ bởi ví các chuỗi đìch mới đƣợc tổng hợp sẽ trở lại bản chất gốc ban đầu sau quá trính biến tình (hiện tuợng này làm giảm sản lƣợng một cách đáng kể) hoặc ức chế sự hính thành sản phẩm PCR. Do đó, điều quyết định tỷ lệ mồi-khuôn là lƣợng và phức hợp của khuôn đƣợc đƣa vào phản ứng PCR để tránh sự hính thành các sản phẩm không đặc hiệu (các dimer).
Lựa chọn mồi:
Chiều dài của mỗi mồi ở khoảng 18-24 bp, nếu mồi có độ dài lớn hơn (30- 35bp) thí dƣờng nhƣ cũng hoạt động trong điều kiện chu kỳ tƣơng tự nhƣ mồi có độ
Đặng Thị Kiều Oanh 30 Cao học K18
dài ngắn, tuy vậy mồi ở độ dài lớn có khả năng tạo các sản phẩm chình, ngăn các sản phẩm phụ trong phản ứng đa mồi.
Nếu có thể, trính tự của mỗi mồi nên đƣợc „bắt đầu‟ và „kết thúc‟ bởi 1-2 cặp GC.
Hai mồi trong cặp cần phải có nhiệt độ tan chảy Tm gần nhau.
Điều kiện chu kỳ và nồng độ đệm phải điều chỉnh cân xứng với mỗi cặp primer để việc khuếch đại các vùng đìch đƣợc đặc hiệu.
Nồng độ mồi
Thông thƣờng, trong mỗi phản ứng PCR đơn (khuếch đại một vùng), nồng độ phân tử dùng cho mỗi mồi từ 100 – 500 nM. Trong phản ứng PCR đa mồi, lƣợng mồi có thể thay đổi từ 500nM đến 15nM (trong nghiên cứu, kết quả cho thấy nếu nồng độ mồi ở 15nM sẽ không nhín thấy sản phẩm, ở 30 nM cho sản phẩm ìt…và sản phẩm PCR xuất hiện rõ nhất ở nồng độ 200nM). Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng nên tránh sử dụng lƣợng mồi quá cao hoặc quá thấp. Lƣợng mồi quá cao có thể gây ức chế phản ứng PCR đa mồi, nhƣng ngƣợc lại lƣợng mồi quá ìt thí không đủ để có sản phẩm khuếch đại. Khi phản ứng khuếch đại diễn ra không đạt yêu cầu, sản phẩm ìt nên khó nhận thấy mặc dù đã tối ƣu các điều kiện của chu kỳ phản ứng thí việc thay đổi tỷ lệ các mồi khác nhau trong phản ứng là cần thiết, bằng cách tăng lƣợng mồi cho sản phẩm yếu hơn (vùng yếu) và giảm lƣợng mồi cho sản phẩm mạnh hơn (vùng mạnh). Nồng độ cuối cùng của các mồi (từ 40 -500nM) có thể thay đổi đáng kể trong vòng vùng này và thƣờng đƣợc thiết lập theo kinh nghiệm [24]. Với DNA có số copy thấp hoặc có tình phức tạp cao thí nồng độ mồi nên dùng từ 300nM - 500nM (0,3 – 0,5µM). Đối với DNA có số copy cao hoặc tình phức tạp thấp nồng độ mồi đƣợc khuyên là từ 40nM – 400nM (0,04-0,4µM) [38].
Sự cân xứng giữa lượng mồi và lượng DNA khuôn (DNA đích)
Một trong những khái niệm quan trọng nhất của PCR là sự phù hợp tối ƣu của tỷ lệ mồi (primer) và „khuôn‟ (DNA của tế bào đìch hay „template‟). Nếu tỷ lệ này quá cao, sản phẩm trùng hợp mồi đƣợc hính thành, nhƣ vẫn xảy ra khi ta pha rất loãng „khuôn‟ hoặc cho dƣ thừa mồi. Mồi luôn phải ở trong mức dƣ thừa 107 phân
Đặng Thị Kiều Oanh 31 Cao học K18
tử đối với khuôn. Trong hầu hết các áp dụng, không kể đến nồng độ của khuôn, nồng độ mồi không đƣợc tăng vƣợt quá 0,5µM ví sản phẩm trùng hợp mồi sẽ đƣợc tạo nên. Tỷ lệ mồi – khuôn quá thấp, sản phẩm sẽ không đƣợc tăng lên theo số mũ bởi ví các chuỗi đìch mới đƣợc tổng hợp sẽ trở lại bản chất gốc ban đầu sau quá trính biến tình (hiện tuợng này làm giảm sản lƣợng một cách đáng kể) hoặc ức chế sự hính thành sản phẩm PCR. Do đó, điều quyết định tỷ lệ mồi-khuôn là lƣợng và phức hợp của khuôn đƣợc đƣa vào phản ứng PCR để tránh sự hính thành các sản phẩm không đặc hiệu (các dimer).
Nồng độ mồi và nồng độ DNA đích:
Trong giới hạn, khi tăng nồng độ mồi có thể tăng kết quả phát hiện gen đìch của phản ứng PCR. Do vậy, tăng nồng độ mồi cũng đƣợc coi nhƣ một cách tối ƣu phản ứng PCR.
Nồng độdNTP và MgCl2
Về dNTP: nồng độ MgCl2 đƣợc giữ ổn định (2mM) trong khi đó tổng nồng độ các dNTP đƣợc tăng dần. Kết quả tốt nhất ở giữa 200-400µM cho mỗi loại dNTP, nếu cao hơn sự khuếch đại bị ức chế nhanh. Nếu thấp hơn (100µM mỗi loại) vẫn có sự khuếch đại nhƣng lƣợng sản phẩm ìt và sản phẩm đƣợc nhín thấy mờ. dNTP (ở dạng cất giữ) nhạy cảm với việc đông/ tan đông. Sau 3-5 lần nhƣ vậy sẽ ảnh hƣởng đến chất lƣợng của phản ứng PCR đa mồi. Để tránh vấn đề này, nên chia nhỏ dNTP và giữ ở nhiệt độ âm (-20oC). Sự kém ổn định này của dNTP không thể hiện rõ khi chỉ khuếch đại 1 trính tự (một vùng).
Về MgCl2, phải tối ƣu hóa Mg++ ví Taq DNA polymerase là 1 enzym phụ thuộc Mg. Cùng với Taq DNA polymerase, mồi của DNA khuôn và dNTPs cũng kết hợp Mg2+. Ví vậy tối ƣu hóa nồng độ Mg2+ phải tùy thuộc nồng độ dNTP, DNA đìch và thành phần đệm (có một số đệm đã có sẵn một lƣợng Mg++). Nếu mồi, DNA đìch chứa chất ức chế nhƣ EDTA hoặc EGTA thí nồng độ Mg2+
có thể thay đổi. Lƣợng Mg2+
thừa làm cho chuỗi kép DNA bền và ngăn cản sự biến tình hoàn toàn của DNA, điều này dẫn đến giảm sản phẩm. Mg2+ dƣ thừa cũng có thể làm bền
Đặng Thị Kiều Oanh 32 Cao học K18
sự bắt cặp không đặc hiệu của mồi với vị trì không chình xác của khuôn dẫn đến làm giảm độ đặc hiệu. Mặt khác nếu không đủ Mg2+ cũng làm giảm sản phẩm khuếch đại [38].
Cân bằng giữa dNTP và MgCl2
Để hoạt động tốt, Taq DNA polymerase cần Mg tự do (dNTP và DNA cũng đƣợc gắn với Mg). Điều này có thể giải thìch tại sao khi tăng nồng độ dNTP có thể ức chế PCR. Trong khi đó tăng nồng độ Mg thƣờng cho hiệu quả tốt. Bằng cách kết hợp lƣợng dNTP và MgCl2 khác nhau. Nghiên cứu cho thấy với 200µM mỗi loại dNTP và 1,5 mM MgCl2 thƣờng có kết quả đạt yêu cầu, tuy nhiên ở nồng độ 3mM MgCl2 thí kết quả có thể tốt hơn. Nồng độ Mg thấp sẽ giảm khả năng khuếch đại của phản ứng PCR [24,38].
Lượng DNA đích (khuôn) và Taq DNA polymerase
Khi lƣợng DNA đìch quá thấp, sự khuếch đại đặc hiệu và hiệu quả có thể đạt đƣợc ở nhiệt độ bắt cặp thấp hơn. Thử nghiệm những nồng độ khác nhau của Taq DNA polymerase cho thấy nồng độ enzym hiệu quả nhất khoảng 2,5U/50µl thể tìch phản ứng. Lƣợng enzym thừa, do nồng độ glycerol ở dung dịch gốc dẫn đến sự khuếch đại không cân xứng giữa các trính tự khác nhau. Tỷ lệ kéo dài của phân tử lai mồi - đìch phụ thuộc vào hoạt tình của enzym này và sự có mặt của các thành phần cần thiết nhƣ MgCl2, dNTP và bản chất của DNA đìch. Ví vậy vấn đề chủ yêú để thay đổi PCR phải tác động trực tiếp đến các yếu tố ảnh hƣởng tới sự bắt cặp hoặc kéo dài hoặc cả hai [38].
Lƣợng gen đìch có mặt trong mẫu ảnh hƣởng mạnh tới hiệu quả PCR. Nếu lƣợng gen đìch rất ìt, điều kiện của phản ứng hay chu trính phản ứng cần phải đƣợc thay đổi, cải tiến để thìch nghi nhằm đạt hiệu quả phát hiện.
Nồng độ đệm PCR
Qua khảo sát cho thấy đệm PCR cho hiệu quả tốt là 1,6 x của các thành phần đệm PCR sau đây: KCl (50mM), Tris HCl pH 8,3 (10mM) và MgCl 2 (1,5mM).
Đặng Thị Kiều Oanh 33 Cao học K18
Một số khảo sát cho thấy tăng nồng độ đệm lên 2 lần sẽ tăng hiệu quả của phản ứng PCR đa mồi. Việc này hiệu quả hơn bất cứ tá dƣợc nào đƣợc thử nghiệm nhƣ DMSO, glycerol hoặc albumin huyết thanh bò. Những cặp mồi với sản phẩm khuếch đại dài hơn hoạt động tốt hơn ở các nồng độ muối thấp hơn trong khi những cặp mồi có sản phẩm khuếch đại ngắn hơn hoạt động tốt hơn ở các nồng độ muối cao hơn [24].
Sử dụng tá dược: DMSO, glycerol, BSA
Những phản ứng PCR đa mồi khó khăn nhất có thể đƣợc cải thiện nhờ việc thêm vào phản ứng những chất nhƣ DMSO, glycerol và formamide.. do chúng làm lỏng lẻo chuỗi DNA giúp cho biến tình khuôn dễ hơn, đặc biệt đối với những DNA đìch lớn, giàu GC.
Trong PCR đa mồi, DMSO và glycerol ở nồng độ 5 – 10% (v/v) giúp tăng hiệu quả khuếch đại của PCR (tăng sản phẩm PCR) và tăng tình đặc hiệu (không có sản phẩm phụ). Tuy nhiên, việc sử dụng những chất phụ thêm này cần đƣợc thử nghiệm trong từng trƣờng hợp. BSA với nồng độ 0,8µg/µl làm tăng hiệu quả PCR hơn rất nhiều so với DMSO hay glycerol [45].
Đặng Thị Kiều Oanh 34 Cao học K18
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU