CHƢƠNG 3:KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả phân lập chủng nấm men đối kháng
Chúng tôi đã tiến hành thu thập 218 mẫu lê và táo từ chợ, siêu thị có nguồn gốc nguồn trong và ngoài nước và tiến hành phân lập các chủng nấm men Candida sake đối kháng. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.
Kết quả ở bảng 3 cho thấy tổng số chủng nấm men đối kháng phân lập được là 55 chủng trên tổng số 218 mẫu quả, chiếm tỉ lệ 25,2%. Trong đó, tỉ lệ chủng nấm men đối kháng phân lập trên lê là 26,7% cao hơn phân lập trên táo là 23,5%.
Bảng 1: Kết quả phân lập củng nấm men đối kháng
Nguồn phân lập mẫu Số
Số chủng nấm men đối kháng phân lập đƣợc Tỷ lệ chủng nấm men đối kháng / số mẫu thu thập (%) Lê (Trung quốc, Bỉ) 120 32 26,7 Táo
(Việt Nam, Trung Quốc, Bỉ) 98 23 23,5
Tổng số 218 55 25,2
- Đánh giá khả năng ức chế nấm mốc gây thối hỏng quả thanh long của các chủng nấm men đối kháng phân lập đƣợc:
Chúng tôi đã tiến hành kiểm tra khả năng ức chế nấm mốc Colletotrichum gloeosporioides và A.niger gây thối hỏng quả thanh long của các chủng nấm men phân lập được. Kết quả được thể hiện ở bảng 2 và bảng 3.
Bảng 2: Khả năng ức chế nấm mốc A.niger gây thối hỏng quả Thanh long của các chủng nấm men đối kháng phân lập được.
Tổng số chủng
Candida phân lập được
Khả năng ức chế nấm mốc A.niger ở các mức độ khác nhau Số chủng ức chế ở
mức độ yếu Số chủng ức chế ở mức độ trung bình Số chủng ức chế ở mức độ mạnh
55 40 13 2
Kết quả bảng 4 cho thấy các chủng nấm men đối kháng phân lập được có khả năng ức chế nấm A.niger gây thối hỏng Thanh long ở các mức độ khác nhau. Có 40 chủng nấm men có khả năng ức chế nấm A.niger ở mức độ yếu chỉ ức chế nấm
A.niger sau 3 ngày nuôi cấy sau đó nấm A.niger lại mọc lại. Có 13 chủng nấm men có khả năng ức chế nấm A.niger ở mức độ trung bình,chỉ ức chế nấm A.niger sau 3 – 5 ngày nuôi cấy, sau đó nấm A.niger lại mọc lại. Có 2 chủng nấm men có khả năng ức chế mạnh nấm A.niger sau 7 – 8 ngày nấm A.niger vẫn chưa mọc lại.
Hình 2: Nấm mốc A.niger bị ức chế hoàn toàn bởi chủng nấm men L1.5.4 đối kháng Bảng 3: Khả năng ức chế nấm mốc Colletotrichum gloeosporioides gây thối hỏng Thanh long của các chủng nấm men đối kháng phân lập được.
Tổng số chủng
Candida phân lập được
Khả năng ức chế nấm mốc Colletotrichum gloeosporioides ở các mức độ Số chủng ức chế ở mức độ yếu Số chủng ức chế ở mức độ trung bình Số chủng ức chế ở mức độ mạnh 55 40 14 1
Kết quả ở bảng 4 và bảng 5 cho thấy trong 55 chủng nấm men đối kháng phân lập được có 40 chủng nấm men có khả năng ức chế ở mức độ yếu với cả 2 loại nấm mốc Colletotrichum gloeosporioides và A.niger chỉ ức chế sau 3 ngày là nấm mốc đã mọc trở lại, có 13 chủng nấm men có khả năng ức chế với nấm mốc A.niger ở mức độ trung bình tức là ức chế được nấm mốc A.niger 5 ngày nấm mốc mới mọc trở lại, nhưng lại có những 14 chủng nấm men có khả năng ức chế nấm mốc
Colletotrichum gloeosporioides ở mức độ trung bình tức là chỉ ức chế được 5 ngày
A.niger ở mức độ mạnh là ức chế được nấm mốc 7 ngày mà nấm mốc không mọc lại, nhưng lại chỉ có 1 chủng nấm men ức chế được cả 2 loại nấm mốc
Colletotrihcum gloeosporioides và A.niger ở mức độ mạnh là ức chế sau 7 ngày mà cả 2 loại nấm mốc Colletotrichum gloeosporioides và A.niger đều không mọc trở lại
.
Hình 3: Nấm mốc Colletotrichum gloeosporioides bị ức chế hoàn toàn bằng chủng nấm men L1.5.4đối kháng
- Đặc điểm sinh hóa của chủng Candida spp. L1 5.4 tuyển chọn đƣợc
Chúng tôi tiến hành đánh giá khẳ năng lên men của chủng nấm men đối kháng phân lập được với các loại đường khác nhau, kết quả được thể hiện ở bảng 4 Bảng 4: Khả năng lên men các loại đường
Tên chủng
Khả năng lên men loại đường Hoạt tính Urease Glucose Maltose Sucrose Lactose
Candida sake L1
5.4
+ + + - +
3.2. Định loại chủng nấm men đối kháng
Chúng tôi tiến hành định loại chủng nấm men L1.5.4 đối kháng phân lập được có khả năng ức chế ma ̣nh với cả 2 loại nấm mốc Colletotrichum gloeosporioides và
A.niger và thu được kết quả như sau:
Tách dòng và đọc trình tự gen ITS và 2,5s để định loại nấm men đối kháng
Cặp mồi dùng để khuếch đại gen ITS và 2,5 S bằng PCR:
ITSP1: TCCTGGTCATTTAGAGGAAGTAAA ITSP2: TAGAGCTGCATTCCCAAACAAC
Trình tự đoạn gen mã hóa rRNA ITS và 2,5s của chủng nấm men đối khángđã được xác định thông cả hai chiều. Trình tự này được so sánh với trình tự gen rRNA ITS và 2,5s của các chủng Candida sake có sẵn trong Ngân hàng dữ liệu gen Quốc tế. Sử dụng chương trình Fasta để tìm kiếm các trình tự tương đồng đã được các tác giả khác công bố và so sánh với trình tự thu nhận được.
Kết quả phân tích theo phần mềm Fasta trình tự một đoạn gen mã hóa rRNA ITS và 2,5s của chủng nấm men đối kháng L1.5.4 có 99,00% nucleotit tương đồng với trình tự gen rRNA ITS và 2,5s của chủng Candida sake đăng trên ngân hàng gen Quốc tế.
ID CsVn_ITS PRELIMINARY; DNA; 708 BP.
SQ SEQUENCE 708 BP; 212 A; 139 C; 156 G; 201 T;
TCCTGGTCAT TTAGAGGAAG TAAAAGTCGT AACAAGGTTT
CCGTAGGTGA CCCTGCGGAA 60
GGATCATTAA AGTTTGCTTA ATTGCATTAC ACATGTTTTT
TTAGAGAACT TGCTTGCAAG 120
AACACTAATA ATTTACTTAG TCAACAAATA AAAATATCAA
AACTTTCAAC AACGGATCTC 180
TTGGTTCTCG CATCGATGAA GAACGCAGCG AAATGCGATA
CGTAATATGA ATTGCAGATT 240
TTCGTGAATC TTCGAATCTT TGAACGCACA TTGCGCCCTG
TGGTATTCCA CAGGGCATGC 300
CTGTTTGAGC GTCATTTCTC CCTCAAACCT CTGGTTTGGC
GTTGAGTGAT ACTCGGTTTA 360
CTTGAAAAAC ATGAAAAGCA TAACTATTAG GTTTTACCAA
CTCGTTATAC TAATCTACAA 420
GTTTGACCTC AAATCAGGTA GGACTAACCG CTGAACTTAA
GCATATCAAT TAGCGGAGGA 480
AAAGAAACCA ACCGGGATTG GCTCAGTAAC GGCGAGTGAA
GCGGCAAAAG CTCAAATTTG 540
AAATCTGCGT AAGCCGAGTT GTAATTTGAA GATGGCTACT
TTGGTAATGG CTCTTGTCTA 600
TGTTCCTTGG AACAGGACGT CACAGAGGGT GAGAATCCCG
TGCGATGAGA TGTCCATTAC 660
CGTGTAAAGT GCTTTCGAAG AGTCGAGTTG TTTGCCAATG CAGCTCTA
Trình tự nucleotide gen mã hóa rRNA ITS và 2,5s của chủng Candida sake L1.5.4 Kết quả định tên bằng phương pháp sinh học phân tử này hoàn toàn phù hợp với kết quả phân loại dựa trên các đặc điểm về hình thái sinh lý nêu trên. Sau khi phân loại theo phương pháp xác định trình tự đoạn gen mã hóa rRNA ITS và 2,5s chúng tôi khẳng định rằng chủng nấm men L1.5.4 đối kháng chính xác thuộc loài
Candida sake.
So sánh với chủng nấm men Candida sake ĐN15 mà Nguyễn Thùy Châu và các cộng sự đã phân lập được trước đó, chúng tôi thấy trình tự nucleotide của đoạn gen ITS và 2,5s của chủng nấm men Candida sake L1.5.4 có sự tương đồng 99,7% so với chủng nấm men Candida sake ĐN15 và chỉ khác biệt ở vị trí nucleotide số 695 và 696 của chủng nấm men Candida sake ĐN15 là GG thì ở chủng nấm men
Candida sake L1.5.4 mà chúng tôi phân lập được là CC.
3.3 Đánh giá hiệu quả bảo quản của các công thức màng bao
3.3.1. Kiểm tra khả năng sống sót của nấm men Candida sake L1.5.4 trên các công thức màng bao
Chúng tôi đã tiến hành xác định khả năng sống sót của nấm men Cadida sake
L1.5.4 ở các công thức màng bao CT27, CT27 cải tiến và màng Chitosan. Kết quả được trình bày ở bảng 5.
Bảng 5: Khả năng sống sót của chủng Candida sake L1.5.4 trên các công thức màng bao khác nhau
Công thức màng bao Mật độ tế bào nấm men Candida sake L1.5.4(CFU/ml) 1 tháng 3 tháng 6 tháng
Màng bao Chitosan 1,81.108 2,12.107 6,1.106
Màng bao CT27 2,19.108 7,3.107 1,23.107
Kết quả bảng 1 cho thấy, khả năng sống sót của Candida sake L1.5.4 ở tất cả các công thức giảm dần theo thời gian bảo quản. Các thành phần có trong màng bao không làm ảnh hưởng tới khả năng của chủng nấm men Candida sake L1.5.4. Khả năng sống sót của chủng nấm men Candida sake L1.5.4 ở công thức màng bao CT27 cải tiến là cao nhất, mật độ tế bào Candida sake L1.5.4 sau 1 tháng, 3 tháng, 6 tháng lần lượt là 2,86.108 ; 1,05.108 ; 0,59.108 tế bào.
3.3.2. Hiệu quả bảo quản quả thanh long của các công thức màng bao
Chúng tôi đã tiến hành tạo các màng bao như sau:
- Công thức màng bao CT 27 gồm các thành phần: Carboxylmethylcellulo (CMC), Glycerol, Axit lactic, Lipit( Dầu ăn), Sữa tách bơ, lòng trắng trứng,
- Cách tiến hành như sau: Cho CMC vào nước hòa tan đều vào nước ở nhiệt độ 45 0C, bổ sung sữa tách bơ đánh tan trong dung di ̣ch trên . Nâng nhiệt lên 50-600C, sau đó cho lòng trắng trứng hoặc protein đậu tương hòa tan tránh kết tủa ở 800
C sau đó nâng nhiệt lên 850C lắc 30 phút, để ở nhiệt độ phòng 15-20 phút, bổ sung lipit và glycerol lắc trong 30 phút.
- Công thức màng bao CT27 cải tiến gồm các thành phần như với CT27 nhưng có bổ sung thêm sáp ong và KMnO4. Với phương pháp làm tương tự công thức CT27
- Màng chitosan : Chitosan 2% + axit lactic 1,5%
Chúng tôi đã tiến hành đánh giá hiệu quả bảo quản quả thanh long của 3 công thức màng bao CT27, CT27 cải tiến và màng Chitosan.
Thanh long chọn quả tươi, rửa sạch, để khô ráo. Dùng chổi mền hoặc khăn mềm phủ đều chế phẩm nấm men Candida sake L1.5.4 đối kháng lên bề mặt quả. Để khô, sau đó phủ tiếp chế phẩm màng bao. Tùy theo từng lô thí nghiệm mà phủ một trong ba loại màng trên, để khô ở nhiệt độ phòng trong 20- 30 phút. Kiểm tra mẫu đinh kì 2 ngày/lần để đánh giá kết quả.Kết quả đánh giá được thể hiện ở bảng 6.
Bảng 6: Hiệu quả bảo quản quả Thanh long bằng các màng bao khác nhau Tên lô thí nghiệm Chỉ tiêu Thời gian bảo quản (ngày) Hao hụt khối lương(%) Biến đổi màu sắc Cường độ hô hấp (mgCO2/k g/h) Độ cứng Cảm quan Đối chứng 30 6,15 11,9 32,4 Mềm Hỏng Màng Chitosan 30 3.48 6,25 18,6 Quả hơi mềm Ngọt nhưng mất mùi vi ̣ ban đầu Màng CT27 30 3,15 5,2 21.5 Quả cứng Vị ngọt đậm Màng CT27 cải tiến 30 2,29 5,15 20,9 Quả cứng Vị ngọt đậm Kết quả bảng 6 cho thấy, sau 30 ngày bảo quản quả thanh long bằng các công thức màng bao cho thấy hao hụt khối lượng quả ở lô đối chứng là cao nhất 6,15%, tiếp đến là lô bảo quản bằng màng Chitosan và lô bảo quản bằng màng bao CT27 lần lượt là 3,48% và 3,15%, độ hao hụt khối lượng quả của lô bảo quản bằng màng bao CT27 cải tiến là nhỏ nhất chỉ 2,29%. Chứng tỏ màng CT27 cải tiến có khả năng ngăn cản sự mất nước của quả tốt hơn so với các loại màng khác.
Về sự biến đổi màu sắc (E ), lô đối chứng có sự biến đổi màu sắc nhiều nhất là 11,9, các lô bảo quản bằng màng Chitosan và màng bao CT27 có sự biến đổi màu sắc it hơn lần lượt là 6,25 và 5,2. Lô bảo quản bằng màng bao CT27 cải tiến có sự biến đổi màu về màu sắc ít nhất chỉ 5,15. Như vậy các công thức sử dụng màng đều làm chậm quá trình biến đổi màu và màng bao CT27 cải tiến là màng cho kết quả tốt nhất.
Kết quả đánh giá cường độ hô hấp của quả ở các công thức màng bao cho thấy ở lô đối chứng cường độ hô hấp của quả là cao nhất 32,4mg/kg, cường độ hô
hấp nhỏ hơn là lô bảo quản bằng màng Chitosan, màng bao CT27và CT27 cải tiến lần lượt là 18,6, 21.5mg/kg, 20,9
Kết quả đánh giá cảm quan của quả như độ cứng và sự ngon ngọt cho thấy ở đối chứng có chất lượng bảo quản quả kém nhất, quả mềm và bị thối ủng, lô bảo quản bằng Chitosan quả hơi mềm và mất đi vị ngọt ban đầu của quả, lô bảo quản bằng màng CT27 và CT27 cải tiến chất lượng quả là tốt nhất, quả cứng và vị ngọt
Hình 5: Thanh long ở lô đối chứng sau 30 ngày bảo quản ở nhiệt độ 8oC
Hình 6: Thanh long bảo quản bằng màng bao Chitosan sau 30 ngày ở nhiệt độ 8o C
Hình 7: Thanh long bảo quản bằng màng bao CT27 cải tiến sau 30 ngày ở nhiệt độ 8 0 C
Kết luận: Từ kết quả so sánh hiệu quả bảo quản của 3 loại màng: màng CT27, CT27 cải tiến và màng Chitosan cho thấy màng CT27 cải tiến cho hiệu quả bảo quản quả thanh long tốt nhất. Quả thanh long được bảo quản bằng màng bao CT27 cải tiến có màu sắc, độ cứng, độ ngon ngọt không khác nhiều so với trước khi bảo quản. Do vậy chọn màng bao CT27 cải tiến kết hợp với nấm men Candida sake
L1.5.4 đối kháng để nghiên cứu tiếp về phương pháp ứng dụng chế phẩm nấm men đối kháng kết hợp với màng bao ăn được để bảo quản quả thanh long ở quy mô lớn.
3.3.3 Đánh giá hiệu quả bảo quản quả của hai phƣơng pháp tạo màng
3.3.3.1 Bảo quản thanh long theo phương pháp bôi chế phẩm Candida sake L1.5.4 kết hợp với màng bao CT27 ở nhiệt độ lạnh 80
C
Chúng tôi đã tiến hành đánh giá hiệu quả bảo quản thanh long theo phương pháp bôi chế phẩm Candida sake L1.5.4 kết hợp với màng bao CT27 cải tiến ở nhiệt độ lạnh 80
C.
Thanh long chọn quả còn tươi, làm sạch, để ráo. Dùng chổi mềm hoặc khăn mềm bôi đều chế phẩm nấm men Candida sake L1.5.4 lên bề mặt quả. Để khô. Dùng chổi mềm bôi đều màng bao ăn được CT27 lên bề mặt quả và đến từng kẽ tai.
Để khô tự nhiên. Bao gói bằng túi LDPE đục lỗ có kích thước túi là 20x 30cm, kích thước lỗ 0,7cm. thanh long được bảo quản ở nhiệt độ lạnh 80
C.
Kết quả bảo quản thanh long theo phương pháp bôi chế phẩm nấm men đối kháng Candida sake L1.5.4 kết hợp với màng bao ăn được CT27 cải tiến được trình bày ở bảng 7.
Bảng 7 Hiệu quả bảo quản thanh long theo phương pháp bôi chế phẩm Candida sake L1.5.4 kết hợp với chế phẩm màng bao CT27 cải tiến ở nhiệt độ lạnh 80C
Lô thí nghiệm
Chỉ tiêu theo dõi
Độ cứng của quả Màu sắc vỏ quả Độ ngon ngọt Tỷ lệ thối hỏng (%) Thời gian bảo quản Lô đối chứng Quả mềm Quả màu thâm đen Thối hỏng 84 28 Lô bảo quản
bằng chế phẩm
Candida sake
và màng bao CT27
Quả cứng Vỏ quả đỏ tươi, tai quả xanh
Vị ngọt đậm 4 28
Kết quả bảng 7 cho thấy, sau 28 ngày bảo quản quả thanh long bằng phương pháp bôi chế phẩm nấm men Candida sake L1.5.4 kết hợp với màng bao ăn được CT27 ở nhiệt độ lạnh 80C, chất lượng thanh long ở lô có sử dụng chế phẩm tốt hơn nhiều so với lô đối chứng không sử dụng chế phẩm. Tỷ lệ thối hỏng của lô đôi chứng là 84 % trong khi ở lô có sử dụng chế phẩm là 4%. Các chỉ tiêu đánh giá về cảm quan như độ cứng của quả, màu sắc và độ ngon ngọt của quả ở lô thí nghiệm đều vượt trội hơn so với lô đối chứng. Điều này cho thấy, chế phẩm Candida sake
L1.5.4 kết hợp với màng bao ăn được CT27 đã có tác đụng kéo dài thời gian bảo quản Thanh long mà vẫn đảm bảo chất lượng quả thanh long.
3.3.3.2 Hiệu quả bảo quản của phương pháp nhúng quả thanh long vào chế phẩm Candida sake L1.5.4 kết hợp với màng bao ăn được CT27 cải tiến.
Chúng tôi đã tiến hành đánh giá hiệu quả bảo quản bằng phương pháp nhúng quả thanh long vào chế phẩm Candida sake L1.5.4 kết hợp với màng bao CT27 ở các mức độ thời gian khác nhau.
Thanh long chọn quả tươi, rửa sạch, để ráo. Nhúng vào thùng đựng dung dịch nấm men đối kháng Candida sake L1.5.4, thanh long được chia ra làm 3 nhóm nhỏ mỗi nhóm thời gian nhúng theo trình tự thời gian là 10s, 20s, 30s, để khô ráo . Sau đó, nhúng tiếp thanh long vào thùng đựng chế phẩm màng bao ăn được CT27 cải tiến, giữ trong dung dịch này khoảng 20 giây rồi lấy ra. Sau khi phủ chế phẩm để