Phƣơng pháp nghiên cứu

2.2.1 Chuẩn bị môi trƣờng và nƣớc cất

- Chuẩn bị dịch chiết malt

Malt đã nghiền nát cho nước vào và nâng nhiệt độ dung dịch đến 45 - 500 C để trong khoảng thời gian từ 30 - 45 phút, rồi lại nâng nhiệt độ dung dịch lên 60-650C trong vòng 45-60 phút, rồi lại tăng tiếp lên nhiệt độ 70-750C trong 15-20 phút. Sau đó lọc lấy dung dịch nước chiết malt, đo nồng độ chất khô đạt 12oBrix. Tùy vào mục đích sử dụng môi trường lỏng hay đặc mà ta có thể cho thêm agar vào. Sau đó hấp môi trường ở 1 atm trong vòng 30 phút, điều chỉnh pH bằng 6.

- Chuẩn bị dịch chiết khoai tây ( Môi trƣờng PDA)

Khoai tây bỏ vỏ thái mỏng đun sôi trong vòng 30 phút, sau đó lọc lấy dịch chiết khoai tây, trung bình cứ khoảng 300gam khoai tây thì được 1 lít dịch chiết, bổ sung thêm glucose (20g/1 lít), agar, điều chỉnh pH bằng 6, hấp ở 0,8at trong vòng 30 phút.

Chuẩn bị nƣớc cất:

2.2.2. Phƣơng pháp phân lập nấm mốc gây thối hỏng quả thanh long

Chọn những quả lành lặn, không sây sát, không sâu bệnh. Các mẫu quả sau thu hoạch để nơi thoáng mát, không xử lý hoá chất hay chất bảo quản.

Cân 1g mẫu vỏ quả Thanh long cắt nhỏ cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước cất vô trùng. Lắc trong 30 phút trên máy minishaker, để lắng ở nhiệt độ phòng. Hút 30- 40l dịch mẫu trải đều bằng que chang trên đĩa thạch chứa môi trường PDA. Nuôi cấy ở 28oC sau 3-5 ngày. Khi các khuẩn lạc xuất hiện, tách riêng từng khuẩn lạc và đưa vào các ống nghiệm chứa môi trường giữ giống đã được thanh trùng.

Định loại các loài nấm mốc gây thối hỏng quả thanh long theo các khóa phân loại sau: 1/ BRNAett.H.L: Illustrated genera of imperfect fungi , Commonwelth Agricultural Bureaux 1971 , 2/Raper and Fennel: 2/the genus Asperrgillus,Williams and Wilkins, Baltimore 1965, 3/ Kenneth.B.Rapper: A manual of the Penicillia,

Baltimore,1972

2.2.3. Phƣơng pháp phân lập nấm men đối kháng

Cân 1gam mẫu vỏ quả táo hoặc lê, cắt nhỏ giã nát cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước cất đã được thanh trùng. Lắc đều trong 30 phút trên máy minishaker, để lắng. Pha loãng dịch trên đến nồng độ 10-6, hút 200 l dịch pha loãng ở 2 nồng độ 10-5 và 10-6 ra hộp Petri có môi trường malt - thạch, chang đều sao cho các bào tử tách đều nhau. Nuôi cấy ở 300

C trong 2-3 ngày. Cấy truyền các khuẩn lạc nấm men

Candida sake điển hình sang môi trường malt thạch nghiêng nuôi ở 280

C trong 2 -3 ngày và tiến hành bảo quản giữ giống ở 4oC.

2.2.4. Phƣơng pháp tuyển chọn chủng nấm men đối kháng nấm mốc gây thối hỏng thanh long

Việc xác định và tuyển chọn các chủng nấm men đã phân lập được có khả năng ức chế các nấm mốc gây thối hỏng quả được tiến hành theo phương pháp sau:

Môi trường malt thạch được phân phối ra các hộp Petri vô trùng. Lấy 1 đầu que cấy sinh khối loài nấm mốc Aspergillus niger, Colletotrichum gloeosporioides

gây thối hỏng quả thanh long từ ống thạch nghiêng giữ giống, cấy chấm điểm vào giữa hộp Petri. Sau đó lấy 1 đầu que cấy sinh khối nấm men cần thử khả năng đối kháng trong ống thạch nghiêng, cấy trùm lên trên nấm mốc vừa cấy trước đó. Các hộp thạch chứa các vi sinh vật trên được nuôi ở 28oC , theo dõi sự phát triển của các nấm mốc, nấm men được nuôi cấy từ ngày thứ 3 đến ngày thứ 7-8, nếu nấm mốc không mọc được ở các hộp Petri sau 3- 7 ngày thì đươ ̣c coi là chủng nấm men có khả năng ức chế nấm mốc gây thối hỏng quả từ mức độ yếu, trung bình và mạnh.

2.2.5.Phƣơng pháp định loại các chủng nấm men Candida sake đối kháng dùng trong bảo quản thanh long

Để định loại các chủng nấm men Candida sake đối kháng dùng trong bảo quản Thanh long chúng tôi đã tiến hành giải trình tự đoạn gen ITS1, 5.8S rRNA, ITS2 và 26S rRNA của các chủng nấm men phân lập được và sử dụng phần mềm FASTA để so sánh với trình tự các đoạn gen này của chủng nấm men trong ngân hàng gen thế giới.

2.2.5.1. Thiết kế cặp mồi theo trình tự của đoạn gen ITS1, 5.8S rRNA, ITS2 và 26S rRNA của chủng Candida sake đã công bố trong ngân hàng gen quốc tế

Cặp mồi để tách dòng đoạn gen ITS1, 5.8S rRNA, ITS2 và 26S rRNA của chủng Candida sake có trình tự như sau:

ITSP1: TCCTGGTCATTTAGAGGAAGTAAA ITSP2: TAGAGCTGCATTCCCAAACAAC

2.2.5.2. Phƣơng pháp tách chiết ADN tổng số của các chủng nấm men phân lập đƣợc theo Molecular cloning của Sambrook và cs.

- Tách chiết ADN

- Định lượng ADN bằng quang phổ kế

- Điện di kiểm tra ADN hệ gen trên gel agaroza 1%

- Tiến hành phản ứng chuỗi polymeraza ( PCR ) để nhân bản đoạn gen ITS1, 5.8S rRNA, ITS2 và 26S rRNA của chủng Candida sake phân lập được

- Biến nạp sản phẩm ghép gen (plasmit tái tổ hợp) bằng sốc nhiệt vào E. coli DH5

- Tách chiết ADN plasmit từ E. coli DH5 - Xử lý ADN bằng enzym giới hạn EcoRI - Tách và tinh sạch ADN plasmit lượng lớn

Giải trình tự đoạn gen ITS1, 5.8S rRNA, ITS2 và 26S rRNA của chủng nấm men phân lập được và Xử lý kết quả bằng phần mềm PC/GENE: Sử dụng phần mềm Fasta để so sánh trình tự gen đã tách dòng được với các trình tự đã công bố trong Ngân hàng Gen Quốc tế.

2.2.6. Nghiên cƣ́ u c ông nghê ̣ nhân nuôi nấm men Candida sake quy mô phòng thí nghiệm

Nấm men Candida sake được tiến hành nuôi cấy ở hê ̣ thống nuôi cấy chìm sục khí quy mô 20 lít/mẻ của Doanh nghiệp khoa học Công Nghệ Xanh THÀNH CHÂU

Chúng tôi tiến hành khảo sát các yếu tố công ngh ệ:

- Khảo sát các nhiệt độ nuôi cấy : 250C, 280C, 30 0C, 320C - Khảo sát các pH ở môi trường nuôi cấy: 6; 6,5 và 7 - Khảo sát thành phần môi trường nuôi cấy gồm :

+ Môi trườ ng nước chiết malt + Môi trườ ng rỉ đường

+ Môi trườ ng rỉ đường có bổ sung muối khoáng

- Khảo sát độ oxy hòa tan trong môi trường nuôi cấy ở 2 mứ c đô ̣: 100%, 90% với thời gian nhân nuôi khác nhau từ 0 giờ đến 60 giờ

Mục đích : lựa cho ̣n ra những yếu tố công nghê ̣ thích hợp nhất để quá trình nhân nuôi nấm men Candida sake đa ̣t lượng sinh khối lớn nhất.

2.2.7. Phƣơng pháp tạo màng bao ăn đƣợc

Phƣơng pháp tạo chế phẩm màng bao ăn đƣợc CT27 dùng để bảo quản quả thanh long

Công thức màng bao CT27 đã được Nguyễn Thùy Châu và cộng sự nghiên cứu và cải tiến.

Thành phần màng bao CT27 gồm: Carboxylmethylcellulo (CMC): 5g

Glycerol: 7g Axit lactic : 3g Lipit( Dầu ăn): 4g Sữa tách bơ: 8g Lòng trắng trứng: 30g Nước cất: 600ml

Phƣơng pháp tạo màng bao

- Cho CMC vào nước hòa tan đều vào nước ở nhiệt độ 45 0C, bổ sung sữa tách bơ đánh tan trong dung di ̣ch trên.

- Nâng nhiệt lên 50-600C, sau đó cho lòng trắng trứng hoặc protein đậu tương hòa tan tránh kết tủa ở 800

C.

- Nâng nhiệt lên 850C lắc 30 phút, để ở nhiệt độ phòng 15-20 phút, bổ sung lipit và glycerol lắc trong 30 phút.

Qui trình sản xuất chế phẩm màng bao ăn được CT27 cải tiến dùng để bảo quản Thanh long

Với mục đích kéo dài thêm thời gian bảo quản Thanh long, chúng tôi tiến hành cải tiến công thức màng bao CT27 thành màng bao CT27 cải tiến. Công thức màng bao CT27 cải tiến có các thành phần như màng bao CT27 nhưng có bổ sung thêm 2 thành phần mới là 6gam sáp ong và 0,2g KMnO4. :

Phƣơng pháp tạo màng bao Chitosan - Chitosan 2% + axit lactic 1,5%

- Mục đích cho axit lactic: để tạo ra PH =3 ( hoặc 4 ) cho Chitosan tan

2..2.8. Phƣơng pháp tạo chế phẩm nấm men đối kháng Candida sake ở quy mô phòng thí nghiệm

Cho nấm men đối kháng được giữ giống ở các ống thạch nghiêng vào các bình tam giác có chứa dịch chiết malt đã được thanh trùng, lên men lắc ở nhiệt độ thường trong vòng 3 ngày, thu được dịch lên men là hỗn dịch nấm men đối kháng. Bổ sung 5% lactoza để bảo quản

2.2.9. Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm kiểm tra hiệu quả bảo quản thanh long của các công thức màng bao

Quả thanh long Bình Thuận sau 2 ngày vận chuyển, đươ ̣c đưa đến nơi tiến hành thí nghiệm và không xử lý bằng bất kỳ các hoá chất bảo quản nào khác.

Thanh long được chia làm 4 lô thí nghiệm bảo nhiệt độ lạnh 80C. Sử du ̣ng 50 quả Thanh long cho mỗi lô thí nghiê ̣m. Tiến hành thí nghiệm trên 3 loại màng bao:

+ Màng bao ăn được CT27 kết hơ ̣p với nấm men Candida sake đối kháng + Màng bao ăn được CT 27 cải tiến kết hợp vớ i nấm men Candida sake đối kháng

+ Màng chitosan kết hợp nấm men Candida sake đối kháng.

Cách áp dụng chế phẩm lên quả: Thanh long sau khi được rửa sạch bằng ngâm quả thanh long trong nước Javen nồng độ 2% trong thời gian 1 đến 2 phút sau đó rửa bằng nước sạch 2 lần và để khô quả trong phòng thí nghiệm, nhúng chế phẩm màng bao CT 27 hoặc CT 27 cải tiến đã pha loãng(1lít màng bao + 2 lít nước sạch) và nấm men Candida sake đối kháng thấm đều lên khắp bề mặt quả. Để khô, đóng thùng carton.

Thí nghiệm được lặp lại 2 lần với các công thức màng bao CT27, CT27 cải tiến và màng chitosan.

Định kỳ lấy mẫu để kiểm tra các chỉ tiêu về khối lượng, màu sắc quả, các chỉ tiêu phân tích và đánh giá cảm quan về: mức độ mốc mọc trên quả, độ cứng của quả, màu sắc quả, vị của quả, tỷ lệ thối hỏng.

2.2.10. Phƣơng phá p đi ̣nh lƣơ ̣ng mật độ vi sinh vâ ̣t trong các mẫu nghiên cứu

Đếm số khuẩn lạc xuất hiê ̣n trên đĩa tha ̣ch có thể suy ra lượng tế bào ( CFU) có trong mẫu mô ̣t cách tương đối theo công thức: CFU/ml(g)= a*1/k*1/V

Trong đó :

a: số khuẩn lạc trung bình xuất hiê ̣n trên đĩa cấy có cùng nồng đô ̣ pha loãng

k: độ pha loãng của di ̣ch được cấy

V: Thể tích di ̣ch pha loãng được cấy trên đĩa thạch

2.2.11 Xác định mức độ ngăn cản trao đổi hơi nƣớc qua màng

Khả năng ngăn cản trao đổi nước của màng tạo thành từ chế phẩm được đánh giá qua sự hao hụt về khối lượng tự nhiên của quả. Cân khối lượng của từng quả ở mỗi công thức trước khi bảo quản và ở mỗi lần lấy mẫu bằng cân phân tích. Hao hụt khối lượng tự nhiên được tính theo công thức:

Xi = 100 x (Mi - Mo ) / Mo Trong đó

- Xi (%) = Hao hụt khối lượng tự nhiên tại thời điểm phân tích thứ i - Mi (g) = Khối lượng quả tại thời điểm phân tích thứ i

- Mo (g) = Khối lượng quả trước khi bảo quản

2.2.12. Xác định mức độ ngăn cản trao đổi khí

Mức độ ngăn cản trao đổi khí được xác định theo phương pháp đo kín bằng máy đo CO2 phần trăm trong môi trường tiểu khí hậu trong bình. Sau đó tính nồng độ CO2 bằng công thức:

X = (A.V.10) / (m.t) Trong đó:

- A: Tỉ lệ % CO2 đo được trong máy (%)

- m: Khối lượng mẫu trong phòng thí nghiệm (kg) - t: Thời gian (giờ - h)

- 10: Hệ số chuyển đổi

2.2.13. Phƣơng pháp đánh giá cảm quan

Quan sát và đánh giá hình thức bên ngoài quả Thanh long theo tính chất cảm quan theo hướng mức độ tươi mới và chấp nhận tiêu dùng. Đánh giá bên trong quả Thanh long bằng cách bổ dọc quả để quan sát màu sắc và tổ chức mô quả của phần thịt và ruột bên trong cũng như ngửi và ăn thử. Lập hội đồng đánh giá cảm quan gồm 5-7 người, có phiếu cảm quan, đánh giá chất lượng theo các mức: Tốt, Khá, Kém, Xấu (hư hỏng, không đánh giá được).

2.2.14. Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm bảo quản quả thanh long bằng chế phẩm

Candida sake kết hợp với chế phẩm màng bao ăn đƣợc ở quy mô phòng thí nghiệm và qui mô lớn

Bố trí mô hình bảo quản quy mô phong thí nghiệm

Thanh long Bình Thuận sau 2 ngày vận chuyển , được đưa đ ến nơi tiến hành thí nghiê ̣m và không xử lý bằng bất kỳ các hoá chất bảo quản nào khác.

Thanh long được chia làm 3 lô, khối lượng 50 quả/ lô:

1/ Lô quả thanh long được bảo quản theo phương pháp bôi 2/ Lô quả thanh long được bảo quản theo phương pháp nhúng 3/ Lô đối chứng

Tất cả các lô đều được bảo quản ở nhiệt độ lạnh 80C

Các chỉ tiêu theo dõi

Quá trình bảo quản theo dõi các chỉ tiêu:  Tỉ lệ thối hỏng

 Độ cứng của quả (cảm quan bằng tay)  Màu sắc của quả (cảm quan bằng mắt)  Độ ngon ngọt (cảm quan bằng vị giác)

Tiến hành theo dõi hàng ngày trên mẫu có phủ màng bao và mẫu đối chứng 2 ngày/lần. Tiến hành thu thập, phân tích, xử lý số liệu dựa trên các chỉ tiêu đã nêu và chụp ảnh làm cơ sở để đánh giá hiệu quả của mô hình.

Phương pháp bảo quản quả thanh long bằng nấm men Candida sake đối kháng kết hợp với màng bao ăn được ở quy mô phòng thí nghiệm

Thanh long được chọn làm thí nghiệm có khối lượng trung bình từ 400 – 500g. Quả có hình dạng tự nhiên, khoang mũi không sâu quá 4cm. Trạng thái quả cứng, bên trong ruột có màu sắc đặc trưng của từng loài thanh long, màu sắc bên ngoài đều.

Thanh long được thu mua về không xử lý bằng bất kỳ hóa chất nào, dùng vải mềm lau sạch bề mặt quả tránh làm gãy tai quả.

Thanh long được chia làm 4 lô:

1/ lô thí nghiệm được bảo quản ở nhiệt độ thường 2/ lô thí nghiệm được bảo quản ở nhiệt độ lạnh 8-100C 3/ lô đối chứng bảo quản ở nhiệt độ thường

4/ lô đối chứng bảo quản ở nhiệt độ lạnh 8-100C,

Lô thí nghiệm được xử lý bằng nấm men đối kháng và màng bao ăn được. Cách làm như sau: nhúng quả thanh long vào hỗn dịch nấm men đối kháng. Để ráo quả. Nhúng tiếp quả thanh long vào dịch màng bao ăn đươ ̣c. Để ráo quả.

Mẫu đối chứng được chia làm 2 lô; 1/ lô bảo quản ở nhiệt độ thường, 2/ lô bảo quản ở nhiệt độ lạnh 8-100C. Các mẫu đối chứng không xử lý bằng nấm men đối kháng và màng bao ăn được. Tiến hành theo dõi các chỉ tiêu khối lượng, số lượng, màu sắc quả, các chỉ tiêu phân tích và đánh giá cảm quan về: mức độ mốc mọc trên quả, độ cứng của quả, màu sắc quả, vị của quả, tỷ lệ thối hỏng.

Quan sát và đánh giá hình thức bên ngoài theo tính chất cảm quan theo hướng mức độ tươi mới và chấp nhận tiêu dùng. Đánh giá bên trong bằng cách bổ dọc quả để quan sát màu sắc và tổ chức mô quả của phần thịt bên trong cũng như ngửi và ăn thử.

Bố trí thí nghiệm bảo quản quả thanh long bằng chế phẩm Candida sake kết hợp với chế phẩm màng bao ăn được ở quy mô lớn tại Bình Thuận

Mô hình ở công ty TNHH Lộc Tú:

Chọn quả thanh long cho bảo quản: Chọn những quả thanh long không bị bệnh, khối lượng khoảng 0, 7-0,8 kg.

1. Rửa thanh long

Quả thanh long ngay sau khi thu hoạch tại vườn được rửa bằng nước Javen hạng thực phẩm ( NaClO) nồng độ 2% và rửa lại bằng nước thường 2 lần. Để ráo quả. Sau đó quả thanh long được chia làm 4 lô như sau:

TN1: 1 lít màng bao MTL1 ( màng CT27) + 1 lít nấm men Candida sake + 2 lít nước

TN 2: 1 lít màng bao MTL1 ( màng CT27) + 1 lít nấm men Candida sake + 3 lít nước

TN 3 : 3 lít màng chitosan pha sẵn ( màng MTL2)

TN 4: Nấm men Candida sake đối kháng tỷ lệ 1 lít nấm men + 3 lít nước TN 5: Đối chứng bằng hóa chất Umikai của công ty Lộc Tú

Các lô thí nghiệm trên được chia thành hai lô lớn là lô có sử dụng túi polyethylen