3. đỐI TƯỢNG, NỘI DUNG PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4. Phương pháp
Thu thập mẫu
Lấy phân trực tiếp từ trực tràng lợn mắc tiêu chảy chưa dùng thuốc (kháng sinh) ựiều trị, cho ngay vào týp, vặn chặt, và ghi ký hiệu mẫu. Sau ựó, cho vào bảo quản lạnh 2 - 4oC trong thùng bảo ôn.
Mẫu ựược bảo quản trong ựiều kiện lạnh 4oC, theo quy trình bảo quản mẫu của bộ môn Vi trùng, viện Thú y và ựược vận chuyển ngay ựến phòng thắ nghiệm ựể tiến hành các xét nghiệm tiếp theo.
Nuôi cấy, phân lập vi khuẩn
Các phương pháp nuôi cấy và giám ựịnh vi khuẩn ựược thực hiện theo quy trình nghiên cứu thường quy của bộ môn Vi trùng, viện Thú y Quốc gia.
Mẫu là phân của lợn có triệu chứng tiêu chảy ựược ria cấy lên các môi trường thạch máu, thạch MacConkey và thạch DHL, bồi dưỡng ở tủ ấm 37oC trong 24 giờ. Trên các ựĩa thạch sau 18 - 24 giờ nuôi cấy ở 37oC, có thể quan sát thấy các dạng khuẩn lạc. Sau ựó chọn khuẩn lạc ựiển hình, làm tiêu bản trên phiến kắnh, nhuộm Gram, kiểm tra hình thái, tắnh chất bắt màu và tiến hành giám ựịnh bằng các ựặc tắnh sinh vật, hoá học của vi khuẩn. Nếu ựược xác ựịnh là thuần khiết thì dùng trong việc xác ựịnh Serotypee và giữ giống ựể tiến hành các thắ nghiệm khác.
Phương pháp phết kắnh: Dùng que cấy vô trùng, lấy một giọt nước sinh lý ựể vào phiến kắnh sạch, dùng que cấy vô trùng lấy một khuẩn lạc ựiển hình vi khuẩn
E.coli, hoà tan phần khuẩn lạc ựã cấy vào giọt nước sinh lý trên phiến kắnh, cố ựịnh tiêu bản trên ngọn ựèn cồn bằng phương pháp hơ trao (không ựể tiêu bản sát ngọn ựèn cồn).
Nhuộm tiêu bản bằng phương pháp nhuộm Gram:
Bước 1: Nhỏ dung dịch tắm Gemxian lên chỗ cố ựịnh vi khuẩn, ựể 1 - 2 phút, rửa sạch bằng nước, vẩy khô.
Bước 2: Nhỏ dung dịch lugol ựể 1 phút, rửa nước, vẩy khô.
Bước 3: đổ cồn axeton chảy qua thật nhanh chỗ phết vi khuẩn ựến khi không còn nhuộm màu nữa, rửa sạch bằng nước, vẩy khô.
Bước 4: Nhỏ dung dịch fucsin ựể 1 phút, rửa nước, vẩy khô.
Dùng giấy thấm thấm khô nước, soi tiêu bản dưới kắnh hiển vi quang học bằng vật kắnh dầu với ựộ phóng ựại 100x, quan sát thấy hình thái và tắnh chất bắt màu của vi khuẩn.
Hình 3.1. Quy trình phân lập vi khuẩn ựường ruột (Bộ môn Vi trùng - viện Thú y) Oxidase âm tắnh Thạch máu Thạch MacConkey E.coli K. pneumoniae Enterobacter aerogenes Salmonella Edwardsiella Proteus Thạch DHL Thạch BG Nước thịt PBW Thạch DHL Thạch BG 37oC/24- 48h/hiếu khắ 37oC/24- 48h/hiếu khắ Salmonella R/Y/H2S+ Mọc trên thạch MacConkey
Trực khuẩn Gram âm
KL ựen trên DHL KL ựỏ trên BG Enterobacteriaceae TSI Lên men ựường Lên men ựường Lên men ựường Mẫu (Phân)
Xác ựịnh số lượng vi khuẩn E.coli và Salmonella trong 1g phân của lợn tiêu chảy và lợn bình thường
Mẫu là 1g phân của lợn bị tiêu chảy và lợn bình thường, ựược pha loãng trong dung dịch PBS thành các nồng ựộ 10-1, 10-2, Ầ, 10-8. Lấy 0,1 ml dung dịch ở các nồng ựộ ựã pha loãng 10-6, 10-7, 10-8 nhỏ và dàn ựều trên bề mặt thạch MacConkey, thạch DHL, bồi dưỡng ở 370C trong 24 giờ. Mỗi nồng ựộ pha loãng dùng 3 ựĩa thạch. đếm số khuẩn lạc E.coli và Salmonella mọc trên ựĩa thạch, rồi tắnh trung bình cho mỗi nồng ựộ.
Số lượng vi khuẩn ựược tắnh theo công thức: X = 10 x a x b
Trong ựó:
X là tổng số lượng vi khuẩn có trong 1g phân hoặc chất chứa. a là số lượng vi khuẩn trung bình của 1 nồng ựộ pha loãng. b là hệ số pha loãng mẫu
Hệ số 10: vì cấy 0,1 ml
Xác ựịnh Serotype kháng nguyên của các chủng vi khuẩn phân lập ựược
Vi khuẩn E. coli:
được thực hiện bằng phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kắnh. Vi khuẩn
E. Coli có nhiều Serotype O khác nhau, do vậy bước quan trọng ựầu tiên là xác ựịnh ựược nhóm Serotype O, sau ựó tiến hành các phản ứng ngưng kết với các kháng huyết thanh ựơn giá trong nhóm cần xác ựịnh. Những nguyên liệu cơ bản cho việc xác ựịnh Serotype gồm:
Các chủng E. Coli cần ựịnh typ ựược giữ trên thạch máu. Các kháng huyết thanh O chuẩn (ựa giá và ựơn giá).
Phương pháp tiến hành phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kắnh ựược tiến hành như sau:
cấy vô trùng lấy khuẩn lạc E. Coli cần xác ựịnh trên môi trường thạch máu trộn ựều với 2 giọt nước muối sinh lý thành huyễn dịch vi khuẩn. Nhỏ một giọt kháng huyết thanh chuẩn vào một bên huyễn dịch và một giọt nước muối sinh lý vào bên huyễn dịch còn lại (ựối chứng). Nếu có phản ứng ngưng kết sẽ xuất hiện sau 1 phút.
Phản ứng dương tắnh khi hình thành ngưng kết giữa kháng nguyên là vi khuẩn với kháng huyết thanh, tạo thành những hạt nhỏ trắng lấm tấm, huyễn dịch tách ra làm 2 phần là các hạt ngưng kết và phần nước trong. Với phản ứng ngưng kết xảy ra nhanh, rõ rệt thì ựược ựánh giá mức ++++. Tuỳ theo khả năng ngưng kết ựể có thể ựánh giá mức ngưng kết ở các mức ựộ khác nhau +, ++, +++.
Phản ứng là âm tắnh khi hỗn dịch vi khuẩn với kháng huyết thanh ựục ựều như bên ựối chứng.
Với những chủng có ngưng kết với kháng huyết thanh nhóm, tiếp tục thực hiện như vậy với các kháng huyết thanh ựơn giá thuộc nhóm ựể xác ựịnh rõ từng Serotype. Trong trường hợp các chủng có hiện tượng ngưng kết chéo với nhiều nhóm hoặc ngưng kết với nhiều ựơn giá khác nhau, thì phải pha loãng kháng huyết thanh theo cấp số 2, kết quả sẽ lấy ngưng kết ở cấp số pha loãng cao nhất.
Vi khuẩn Salmonella:
được tiến hành ựịnh typ theo phương pháp Kauffmann (1972). Xác ựịnh nhóm kháng nguyên O bằng huyết thanh ựa giá:
Sử dụng phản ứng ngưng kết nhanh với kháng nguyên sống trên phiến kắnh (Slide agglutination) ựể xác ựịnh nhóm kháng nguyên O của vi khuẩn Salmonella. Phương pháp tiến hành như sau:
Phiến kắnh sạch ựược chia làm 2 phần. Dùng ống hút Pasteur hoặc que cấy vô trùng, nhỏ mỗi bên phiến kắnh 1 giọt nước sinh lý. Dùng que cấy vô trùng, lấy một ắt khuẩn lạc ựiển hình của chủng vi khuẩn Salmonella cần ựịnh typ ựã mọc trên môi trường thạch máu, trộn ựều với nước sinh lý ựã nhỏ sẵn ở 2 bên phiến kắnh thành huyễn dịch kháng nguyên. Sau ựó, tiến hành nhỏ 1 giọt huyết thanh ựa giá nhóm O vào huyễn dịch kháng nguyên ựã chuẩn bị ở bên thắ nghiệm, còn bên ựối
chứng thì nhỏ 1 giọt nước sinh lý (ựối chứng âm) và trộn ựều. Sau 1 - 2 phút ựọc kết quả.
Phản ứng dương tắnh khi có cụm ngưng kết xuất hiện, nước xung quanh trong.
đối chứng âm: hỗn dịch vẫn ựục ựều.
Nếu hỗn hợp cả 2 ựầu phiến kắnh ựều xuất hiện hiện tượng ngưng kết là ngưng kết giả do vi khuẩn tự ngưng kết, phải tiến hành làm lại.
Xác ựịnh Serotype kháng nguyên O bằng huyết thanh ựơn giá:
Chọn những chủng Salmonella ựã ngưng kết với huyết thanh ựa giá nhóm O, tiến hành làm phản ứng ngưng kết như trên với tất cả các huyết thanh nhóm O ựơn giá thuộc nhóm ựã ngưng kết. Nếu chủng vi khuẩn ngưng kết với huyết thanh O ựơn giá nào thì thuộc Serotype O ựó.
Xác ựịnh kháng nguyên H với kháng huyết thanh H ựa giá:
Cho vào ống tuyp chứa 2,5ml canh trùng một lượng tương ựương dung dịch Salin và formol. để ở nhiệt ựộ phòng trong 3 giờ. Sau ựó, lấy 1 tuyp vô trùng mới, cho vào ựó 0,25 ml hỗn dịch nói trên, cho thêm vào ựó 0,25 ml kháng huyết thanh ựã pha sẵn hoặc 1 giọt kháng huyết thanh H ựa giá, ựun cách thuỷ 50ồC trong 1 giờ.
đọc kết quả:
Phản ứng dương tắnh khi kháng nguyên và kháng huyết thanh kết hợp với nhau, tạo nên những cụm kết tủa bông rõ ở ựáy ống nghiệm.
Phản ứng âm tắnh khi không thấy những cụm bông kết tủa ở ựáy ống nghiệm. Xác ựịnh kháng huyết thanh H ựơn giá:
Tương tự như xác ựịnh kháng nguyên O ựơn giá nhưng phải tiến hành làm phản ứng với 2 pha: phase 1 (ựặc hiệu) và phase 2 (không ựặc hiệu).
Xác ựịnh khả năng mẫn cảm với kháng sinh của các chủng vi khuẩn E.coli và Salmonella phân lập ựược
Khả năng mẫn cảm với kháng sinh của các chủng vi khuẩn phân lập ựược kiểm tra bằng phương pháp khuyếch tán trên thạch và ựánh giá kết quả theo Hội ựồng Quốc gia Hoa Kỳ về các tiêu chuẩn lâm sàng phòng thắ nghiệm (NCCLS) (1999). Phương pháp tiến hành như sau:
Bước 1: Chuẩn bị môi trường thạch ựĩa Muller Hinton.
Bước 2: Các chủng vi khuẩn ựược nuôi cấy trong môi trường thạch máu ở 37oC. Lấy 1 khuẩn lạc, hoà vào 1,5 ml nước sinh lý ựể ựạt ựược ựộ ựục 0,5 trong dãy so màu McFarland. Dùng tăm bông vô trùng, tẩm dung dịch ựã pha loãng và dàn ựều lên thạch ựĩa Muller Hinton.
Bước 3: Dùng máy tự ựộng ựặt các khoanh giấy tẩm kháng sinh của hãng Oxoid (Anh) lên mặt ựĩa thạch.
Bước 4: Bồi dưỡng ựĩa thạch ở 370C/18 - 24 giờ. đọc kết quả bằng cách ựo ựường kắnh vòng vô khuẩn và so sánh với bảng chuẩn ựể ựánh giá mức ựộ mẫn cảm hay kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn kiểm tra.
Bảng 3.1. Tiêu chuẩn ựánh giá mức ựộ mẫn cảm và kháng kháng sinh theo NCLS (1999)
Vòng vô khuẩn (ựường kắnh mm) Kháng sinh Kháng Mẫn cảm trung bình Mẫn cảm Trimethoprim-Sulphamethoxazole < 10 11 - 15 ≥16 Streptomycin < 11 12 - 14 ≥ 15 Gentamicin < 12 13 - 17 ≥ 18 Neomycin < 12 13 - 14 ≥ 15 Cephalothin (KF 30) < 14 15 - 17 ≥18 Amikacin (AK30) < 14 15 - 16 ≥17 Apramycin (APR 15) < 10 11 - 14 ≥15 Ceftiofur (EFT 30) < 17 18 - 20 ≥21 Lincospectinomycin < 10 11 - 13 ≥14 Enrofloxacin (Batril) < 16 17 - 19 ≥20 Ampicillin < 11 12 - 14 ≥ 15 Tetracyclin < 14 15 - 18 ≥ 19
Tiến hành ựiều trị thử nghiệm
Từ kết quả xác ựịnh khả năng mẫn cảm kháng sinh của các chủng vi khuẩn phân lập ựược, chúng tôi ựã tiến hành lựa chọn một số phác ựồ ựể ựiều trị thử nghiệm cho các lợn bị tiêu chảy. để ựánh giá ựược hiệu quả một cách khách quan, các phác ựồ ựược thực hiện có sự ựồng ựều tương ựối về các tiêu chắ cơ bản sau:
Số lợn tiêu chảy ở cùng một ựịa phương ựược phân ra làm 3 lô tương ứng với 3 phác ựồ ựiều trị bệnh. Trong 3 phác ựồ ựó có sự khác nhau về việc sử dụng thuốc kháng sinh.
Số lần và ngày ựiều trị bệnh ựược dùng ựồng ựều trong các phác ựồ.
đánh giá hiệu quả của các phác ựồ ựiều trị căn cứ vào sự ổn ựịnh dần trạng thái phân, tình trạng ăn, uống... sau 4 - 7 ngày, kể từ khi dùng thuốc.
Xử lý số liệu
Toàn bộ số liệu ựược xử lý theo phương pháp thống kê sinh học bằng phần mền Microsoft Office Excel 2003.
Các tham số cơ bản: Giá trị trung bình Trường hợp mẫu < 30: n x X− = ∑ i (với n từ 1 ựến i). Trường hợp mẫu > 30 : n S K A X i 0 + = − độ lệch tiêu chuẩn : 1 ) ( 2 − − ổ = ∑ − − n x x x S
Sai số của số trung bình: Trường hợp mẫu < 30: 1 − ổ = − − n s m x x Trường hợp mẫu > 30: n S m x x − − =ổ
So sánh sự sai khác giữa các lô thắ nghiệm:
22 2 2 1 2 1 x x TN m m X X t + − = − −