2.3.1. Phương pháp phân tích hóa học
2.3.1.1. Xác định hàm lượng nitơ axit amin theo phương pháp formol [2]
Nguyên tắc: Dựa vào tính chất lưỡng tính của axit amin trong dung dịch nước, trong phân tử của nó có cùng một lúc hai nhóm chức là nhóm cacboxyl (- COOH) và nhóm amin (-NH2), cả hai nhóm chức này đều kém điện li. Khi cho formol vào dung dịch axit amin thì formol sẽ tác dụng với nhóm amin (-NH2) của axit amin và khóa nhóm này lại khi đó nhóm (-COOH) thể hiện rõ tính axit. Sau đó, dùng dung dịch kiềm chuẩn để định lượng axit hình thành, từ lượng kiềm tiêu tốn xác định được hàm lượng nitơ axit amin.
2.3.1.2. Xác định hàm lượng NH3 theo phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước [2] nước [2]
Nguyên tắc: Dùng một dung dịch mạnh hơn NH3 để đẩy nó ra khỏi thực phẩm (nhưng không quá mạnh). Dùng hơi nước để lôi cuốn NH3. Định lượng NH3
bay ra bằng dung dịch H2SO4 0,1N dư để hấp thụ hết NH3 bay ra sau đó dùng kiềm 0,1N chuẩn để xác định lượng axit dư từ đó ta tính được hàm lượng nitơ NH3 hoặc hàm lượng NH3 trong thực phẩm.
2.3.1.3. Xác định hàm lượng phytat theo phương pháp Wade [12], [14]
Nguyên tắc: Sử dụng dung dịch HCl 2,4% để chiết axit phytic ra khỏi mẫu, sau đó bổ sung dung dịch Wade (0,03% FeCl3 và 0,3% axit sulfosalisylic) để phản ứng với axit phytic, lượng dung dịch Wade không tác dụng với axit phytic được xác định bằng cách so màu ở bước sóng 500nm, từ đó tính được hàm lượng axit phytic đã tác dụng với dung dịch Wade.
2.3.1.4. Xác định hoạt độ phytase bằng cách đo đường kính vòng thủy phân
Nguyên tắc: Cho phytase tác dụng lên cơ chấtphytat trong môi trường thạch, cơ chất bị phân giải, độ đục của môi trường bị giảm, môi trường trở nên trong suốt. Độ lớn của vòng phân giải phản ánh mức độ hoạt động của phytase.
2.3.1.5. Xác định hoạt độ protease bằng cách đo đường kính vòng thủy phân
Nguyên tắc: Cho protease tác dụng lên cơ chất protein trong môi trường thạch, cơ chất bị phân giải, độ đục của môi trường bị giảm, môi trường trở nên trong suốt. Độ lớn của vòng phân giải phản ánh mức độ hoạt động của protease.
2.4. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát2.4.1. Sơ đồ tổng quát 2.4.1. Sơ đồ tổng quát
Hình 2.1: Sơ đồ nghiên cứu tổng quát
Bã sắn Phối trộn Hấp vô trùng Để nguội Ủ Xay nhỏ Nước Đậu nành Cám gạo Rỉ đường Bacillus subtilis C7 Nghiên cứu xác định tỷ lệ đậu nành bổ sung
Xác định hoạt độ phytase, protease Xác định hiệu suất thủy phân
Chọn thông số thích hợp Nghiên cứu xác định nhiệt độủ Nghiên cứu xác định tỷ lệ nước/ hỗn hợp Nghiên cứu xác định thành phần môi trường Nghiên cứu xác định thời gian ủ
2.4.2. Thuyết minh
Chuẩn bị nguyên vật liệu
- Chủng vi khuẩn Bacillus subtilis C7 được lấy từ phòng thí nghiệm Vi sinh, Khoa Công nghệ Thực phẩm trường Đại học Nha Trang.
- Bã sắn: bã sắn khô sau khi được thu mua ở cơ sở sản xuất tinh bột tại thành phố Cam Ranh, tỉnh Khánh Hòa được làm khô đến độ ẩm 10- 11% và bảo quản ở điều kiện thường. Sau đó, được xay nhỏ để làm cho bã sắn có kích thước đồng đều, tăng diện tích tiếp xúc với vi khuẩn Bacillus subtilisC7, thúc đẩy nhanh quá trình thủy phân bã sắn.
- Đậu nành: được sấy khô đến độ ẩm trong khoảng từ 10- 11% được bảo quản ở điều kiện thường sau đó tiến hành xay nhỏ để làm tăng diện tích tiếp xúc và tạo điều kiện cho vi khuẩn Bacillus subtilis C7 sinh enzym thủy phân.
- Cám gạo: nên sử dụng cám tốt, cám mới không có vị chua, vị đắng, không hôi, không có mùi mốc. Độ ẩm của cám gạo 14%.
- Rỉ đường: chứa hàm lượng các chất khoáng cao như canxi, magie, kali, sắt và một lượng nhỏ các vitamin. Độ ẩm rỉ đường là 48%.
Phối trộn
Bã sắn được trộn với 5% bột đậu nành, sau đó bổ sung nước với tỷ lệ nước/ hỗn hợp (bã sắn + đậu nành) là 2/1.
Nghiên cứu bổ sung thêm một số thành phần khác như cám gạo, rỉ đường để tăng thêm thành phần dinh dưỡng cho hỗn hợp nguyên liệu tạo điều kiện thuận lợi cho vi
khuẩn Bacillus subtilis C7 sinh trưởng, phát triển và sinh enzym thủy phân protein,
phytat trong quá trình ủ.
Hấp vô trùng
Mục đích: tiêu diệt vi sinh vật, tránh hiện tượng nhiễm tạp các loại vi sinh vật khác khi ủ bã sắn với chủng Bacillus subtilis C7.
Tiến hành hấp vô trùng ở nhiệt độ 1210C, thời gian 15 phút.
Làm nguội, bổ sung chế phẩm
Bacillus subtilis C7 vào với tỷ lệ là 106CFU/ g hỗn hợp.
2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm
2.5.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian ủ
Mục đích: xác định được thời gian ủ thích hợp để hiệu quả của quá trình thủy phân phytat, protein là cao nhất.
Cách tiến hành: bã sắn sau khi xay nhỏ được phối trộn với 5% bột đậu nành, tỷ lệ nước/ hỗn hợp là 2/1. Hỗn hợp được hấp vô trùng ở nhiệt độ 1210C trong 15phút. Sau đó, hỗn hợp được làm nguội, Bacillus subtilisC7 được bổ sung vào với tỷ lệ 106CFU/g hỗn hợp rồi tiến hành ủ ở nhiệt độ phòng với thời gian ủ lần lượt là 0, 12, 24, 36, 48, 60, 72 giờ. Sau từng thời gian ủ, tiến hành xác định hoạt độ phytase, protease và xác định hiệu suất thủy phân phytat và protein để chọn thời gian ủ thích hợp.
Bã sắn
Hình 2.2: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian ủ
Bacillus subtilis C7 Xay nhỏ Phối trộn Ủ(giờ) Chọn thời gian ủ thích hợp Nước: hỗn hợp= 2/1 Đậu nành: 5% Hấp vô trùng
- Xác định hoạt độ phytase, protease
- Xác định hiệu suất thủy phân phytat, protein 36
24 12
2.5.2. Sơ đồ bố trí nghiệm xác định nhiệt độ ủ
Mục đích: xác định được nhiệt độ thích hợp để Bacillus subtilis C7 sinh trưởng, phát triển và sinh enzym thủy phân phytat và protein.
Cách tiến hành: bã sắn sau khi xay nhỏ được phối trộn với 5% bột đậu nành, tỷ lệ nước/ hỗn hợp (bã sắn, đậu nành) là 2/1. Hỗn hợp được hấp vô trùng ở nhiệt độ 1210C trong 15 phút. Sau đó, hỗn hợp được làm nguội, Bacillus subtilis C7 cho vào với tỷ lệ 106CFU/g hỗn hợp rồi tiến hành ủ ở các nhiệt độ khác nhau lần lượt là 25±10C, 30±10C, 37±10C, thời gian ủ đã được xác định từ kết quả thí nghiệm trên. Tiến hành xác định hoạt độ phytase, protease và hiệu suất thủy phân phytat, protein đểxác định nhiệt độ ủ thích hợp.
Bã sắn
30 ± 1 37 ± 1
25 ± 1
-Xác định hoạt độ phytase, protease
-Xác định hiệu suất thủy phân protein, phytat
Chọn nhiệt độ ủ thích hợp Xay nhỏ Phối trộn Hấp vô trùng Nhiệt độ ủ (độ C) Đậu nành: 5% Nước/hỗn hợp= 2/1 Bacillus subtilis C7
2.5.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ nước
Mục đích: nước là môi trường khuếch tán enzym và cơ chất, trực tiếp tham gia vào phản ứng thủy phân và ảnh hưởng rất lớn đến tốc độ thủy phân, rút ngắn thời gian và giảm chi phí.
Cách tiến hành: bã sắn sau khi xay nhỏ được phối trộn với 5% bột đậu nành, tỷ lệ nước/ hỗn hợp lần lượt là 1/1; 1,5/1; 2/1; 2,5/1. Hỗn hợp được hấp vô trùng ở nhiệt độ 1210C trong 15 phút. Sau đó, hỗn hợp được làm nguội, Bacillus subtilis C7 được bổ sung với tỷ lệ 106CFU/g hỗn hợp rồi tiến hành ủ ở nhiệt độ và thời gian như xác định ở trên. Tiến hành xác định hoạt độ phytase, protease vàhiệu suất thủy phân phytat, protein để xác định tỷ lệ nước thích hợp.
Bã sắn Chọn tỷ lệ nước thích hợp Xay nhỏ 1,5/1 2/1 2,5/1 1/1 Ủ
Xác định hiệu suất thủy phân phytat, protein Phối trộn
Tỷ lệ nước/ hỗn hợp Đậu nành: 5%
Bacillus subtilis C7
Hình 2.4: Sơ đồ bố trí thí nghiệmxác định tỷ lệ nước
2.5.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thành phầnmôi trường
Mục đích: Nhằm tìm được môi trường dinh dưỡng phù hợp cho vi khuẩn
Bacillus subtilis C7 phát triển sinh protease, phytase. Để hiệu quả thủy phân
protein, phytat đạt mức cao.
Ngoài bã sắn và đậu nành tiến hành nghiên cứu bổ sung một số thành phần khác là cám gạo, rỉ đường để lựa chọn thành phần môi trường thích hợp cho
Bacillus subtilisC7 sinh trưởng và phát triển hoạt động sinh protease, phytase thúc
đẩy quá trình thủy phân protein, phytat.
Cách tiến hành:
Chuẩn bị 4 mẫu với 4 công thức thành phần môi trường: Bã sắn
Hình 2.5: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thành phần môi trường
Xác định hoạt độ protease, phytase
Xác định hiệu suất thủy phân protein, phytat Để nguội Hấp vô trùng Nước Đậu nành + cám gạo Đậu nành+ rỉ đường Đậu nành+ rỉ đường + cám gạo Đậu nành Ủ Bacillus subtilis C7 Chọn thành phần môi trường thích hợp Phối trộn với các thành phần
- Công thức 1: Thành phần môi trường gồm 85% bã sắn ,5% đậu nành, 10% cám gạo.
- Công thức2: Thành phần môi trường gồm 85% bã sắn, 5% đậu nành, 10% rỉ đường.
- Công thức 3: Thành phần môi trường gồm 85% bã sắn, 5% đậu nành, 5% cám gạo, 5% rỉ đường
- Công thức4: Thành phần môi trường gồm 95% bã sắn, 5% đậu nành
- Hỗn hợp được bổ sung thêm nước với tỷ lệ nước/ hỗn hợp đã được chọn từ thí nghiệm trước và hấp vô trùng ở nhiệt độ 1210C trong 15 phút. Sau đó, hỗn hợp được làm nguội, Bacillus subtilis C7 cho vào với tỷ lệ 106CFU/g hỗn hợp rồi tiến hành ủ ở thời gian và nhiệt độ đã chọn từ thí nghiệm trước. Tiến hành xác định hoạt độ phytase, protease và hiệu suất thủy phân phytat, protein để chọn thành phần môi trường thích hợp.
2.5.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ bột đậu nành bổ sung
Mục đích thí nghiệm: bột đậu nành là nguồn cung cấp cơ chất quan trọng cho vi khuẩn hoạt động như cung cấp nguồn cacbon, nitơ, khoáng chất thúc đẩy quá trình sinh tổng hợp enzym nâng cao hiệu quả thủy phân protein, phytat.
Cách tiến hành: bã sắn sau khi xay nhỏ được phối trộn với bột đậu nành có tỷ lệ lần lượt là 0%, 5%, 10%, 15%, 20%, tỷ lệ nước/ hỗn hợp là 2/1. Hỗn hợp được hấp vô trùng ở nhiệt độ 1210C trong 15 phút. Sau đó, hỗn hợp được làm nguội, bổ sung Bacillus subtilis C7 với tỷ lệ 106CFU/g hỗn hợp rồi tiến hành ủ với thời gian ủ và nhiệt độ ủ đã xác định từ kết quả của thí nghiệm trên. Sau đó, tiến hành xác định hoạt độ protease, phytase và hiệu suất thủy phân protein và phytat để xác định tỷ lệ đậu nành bổ sung thích hợp.
2.6. Các thiết bị thí nghiệm chủ yếu đã sử dụng
- Máy đo pHđể bàn Winlab - Thiết bị chưng cất amoniac - Máy so màu UV- Vis - Máy lắc
- Nồi hấp - Tủ sấy
- Tủ cấy, tủ ấm
Hình 2.6: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ bột đậu nành bổ sung Tỷ lệ bột đậu nành bổ sung (%) 10 15 20 5 0 Ủ
-Xác định hoạt độ phytase, protease
-Xác định hiệu suất thủy phân protein, phytat
Chọn tỷ lệ bộtđậu nành bổ sung thích hợp Xay nhỏ Phối trộn Hấp vô trùng Bã sắn Nước/ hỗn hợp = 2/1 Bacillus subtilis C7
2.7. Phương pháp xử lí số liệu
- Thí nghiệm đều tiến hành 3 lần và được xử lý thống kê để có số liệu chính xác và đánh giá được sự khác biệt giữa các số liệu. Kết quả là trung bình cộng của các lần thí nghiệm ± SD.
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Ảnh hưởng của thời gian ủ đến quá trình thủy phân phytat, protein 3.1.1. Ảnh hưởng của thời gian ủ đến quá trình thủy phân
3.1.1.1.Ảnh hưởng của thời gian ủ đến hoạt độ phytase
Thí nghiệm được tiến hành theo sơ đồ 2.2 và 1.4 (Phụ lục 1), kết quả thí nghiệm được trình bày ở bảng 2.1 (Phụ lục 2) và hình 3.1 dưới đây:
(Các chữ cái a, b, c, d, e, f thể hiện sự khác nhau có ý nghĩa thống kê giữa các giá trị trung bình)
Từ đồ thị hình 3.1 cho thấy:
Hoạt độ của phytase tăng đều khi ủ từ 12- 60 giờ. Cụ thể là, khi ủ 12 giờ đường kính vòng thủy phân phytat 2,08 ± 0,30 mm. Khi tăng thời gian ủ lên 48 và 60 giờ thì đường kính vòng thủy phân phytat lần lượt là 5,75 ± 0,50mm và 8,25 ± 1,04mm. Sau đó, nếu tiếp tục tăng thời gian ủ lên 72 giờ, thì hoạt độ của enzym giảm, đường kính vòng thủy phân phytat giảm dần 7,13± 0,85 mm.
Điều này có thể giải thích như sau:
Giai đoạn đầu từ 12 đến 60 giờ, Bacillus subtilis C7 làm quen với môi trường và sử dụng nguồn cơ chất có sẵn trong môi trường nuôi cấy sinh trưởng, phát triển và sinh tổng hợp phytase để thủy phân phytat nên hoạt động của enzym tăng. Tuy
Hình 3.1: Ảnh hưởng của thời gian ủ đến hoạt độ phytase
2,08a 3,38b 4,55c 5,75d 8,25e 7,13f 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 12 24 36 48 60 72 Đ ườ n g k ín h vòn g th ủ y p h ân p h yt at ( m m )
nhiên, nếu tiếp tục tăng thời gian ủ thì hoạt độ của phytase có xu hướng giảm vì nguồn cơ chấttrong môi trường nuôi cấy giảm,Bacillus subtilis C7 chuyển sang giai đoạn sinh bào tử.
3.1.1.2. Ảnh hưởng của thời gian ủ đến hiệu suất thủy phân phytat
Thí nghiệm được tiến hành theo sơ đồ 2.2, kết quả thí nghiệm được trình bày ở bảng 2.2 (Phụ lục 2) và hình 3.2 dưới đây:
(Các chữ cái a, b, c, d, e, f thể hiện sự khác nhau có ý nghĩa thống kê giữa các giá trị trung bình)
Từ đồ thị hình 3.2 cho thấy:
Khi tăng thời gian ủ bã sắn với chủng vi khuẩn Bacillus subtilis C7 từ 0 giờ đến 60 giờ thì hiệu suất thủy phân phytat tăng đặc biệt trong khoảng thời gian từ 12 giờ đến 48 giờ. Cụ thể, khi ủ 12 giờ, hiệu suất thủy phân phytat đạt 21,94 ± 1,08%, nếu tăng thời gian ủ lên 48 giờ thì hiệu suất thủy phân phytat tăng đến 36,98 ± 1,86%. Tuy nhiên, nếu tiếp tục tăng thời gian ủ lên 60 giờ và 72 giờ thì hiệu suất thủy phân phytat không khác nhau. Kết quả nghiên cứu của Marfo and Oke (1988), cũng cho thấy quá trình lên men có thể giảm được 88% phytat trong vỏ sắn, giảm nhanh trong 48 giờ, chậm dần sau 72 giờ. [17]
Hình 3.2: Ảnh hưởng của thời gian ủ đến hiệu suất thủy phân phytat
21,94a 28,34b 30,38b 36,98c 40,06d 42,16d 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 12 24 36 48 60 72 Hiệu suất thủy phân phytat (%)
Trong khoảng thời gian ủ từ 48 đến 60 giờ khả năng sinh tổng hợp và hoạt động của phytase là mạnh nhất. Tuy nhiên, thời gian càng dài thì môi trường thiếu chất dinh dưỡng, hoạt động của vi sinh vật giảm, khả năng sinh enzym giảm dẫn đến hiệu suất thủy phân phytat giảm.
3.1.2. Ảnh hưởng của thời gian ủ đến quá trình thủy phân protein3.1.2.1. Ảnh hưởng của thời gian ủ đến hoạt độ protease 3.1.2.1. Ảnh hưởng của thời gian ủ đến hoạt độ protease
Thí nghiệm được tiến hành theo sơ đồ 2.2, kết quả thí nghiệm được trình bày ở bảng 2.3 (Phụ lục 2) và hình 3.3 dưới đây:
Hình 3.3: Ảnh hưởng của thời gian ủ đến hoạt độ protease.
(Các chữ cái a, b, c, d, e, f thể hiện sự khác nhau có ý nghĩa thống kê giữa các giá trị trung bình)
Từ đồ thị hình 3.3 cho thấy:
Thời gian ủ ảnh hưởng đến hoạt độ protease. Hoạt độ protease tăng cao ở thời gian ủ từ 12đến 36 giờ sau đó nếu tăng thời gian ủ từ 48 đến 84 giờ thì hoạt độ protease giảm. Cụ thể, ở thời gian ủ từ 12 đến 36 giờ đường kính vòng thủy phân protein lần lượt là 3,00 ± 0,82; 8,40 ± 0,57mm; 7,00 ± 0,71mm. Nếu tăng thời gian ủ đến 84 giờ đường kính vòng phân giải còn 2,05 ± 0,10mm.
Điều này có thể giải thích như sau:
Giai đoạn đầu từ 12 đến 48 giờ, Bacillus subtilis C7 sử dụng nguồn cơ chất có sẵn trong môi trường nuôi cấy sinh trưởng, phát triển và sinh tổng hợp protease