1. 2.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình thủyphân
2.1.2. Enzyme Protamex và Flavourzyme
Enzyme Protamex có nguồn vật Bacillus của Novozyme (Đan mạch). Nó được sản xuất để thủy phân protein của thực phẩm. Hiện nay enzyme này đang được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu và thực tiễn sản xuất [28]
Enzyme Protamex có hoạt độ 1,5 AU/g, Hoạt động thích hợp trong khoảng pH = 5,5 – 7,5; nhiệt độ 350C – 600C. Protamex bị mất hoạt tính trong 30 phút ở 500C khi pH = 4 và trong 10 phút tại 850C hoặc cao hơn [28].
2.1.2.2 Enzyme Flavourzyme
Enzyme Flavourzyme: là một protease được chiết xuất từ nấm Aspergillus oryzae. Hỗn hợp enzyme này có nhiệt độ hoạt động ở 40oC ÷ 60oC, hoạt động thích hợp ở nhiệt độ 40oC ÷ 60oC, pH hoạt động nằm trong khoảng 5,0 ÷ 7,0 [29].
Chế phẩm này của hãng Novozymes sản xuất và đã được tổ chức FAO cho phép sử dụng trong thực phẩm. Nó bao gồm tính chất của một endoprotease và exoprotease. Enzyme này bị bất hoạt ở 85oC trong 10 phút hoặc cao hơn. Tuy nhiên, sự khử hoạt tính của Flavourzyme phụ thuộc nhiều vào cơ chất, điều kiện môi trường hoạt động (nồng độ cơ chất, pH …) [29].
Hiện nay, Flavourzyme thường được ứng dụng trên thực tế, dùng để thủy phân protein trong thực phẩm. Hoạt độ của nó là 500 LAPU/g (Leucine Amino Peptidase). 1LAPU là lượng enzyme cần để thủy phân 1 µmol of L-leucine- pnitroanilide trong 1 phút [29].
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Xác định thành phần hóa học của phế liệu đầu cá ngừ
Hình 2.4. Sơ đồxác định thành phần hóa học của đầu cá Ngừ
Tiến hành cân khối lượng đầu cá ngừ đã chuẩn bị từ trước đem đi xác định thành phần hóa học: hàm lượng nước, lipid, protein, khoáng tan trong HCl. Mỗi thành phần hóa học lặp lại 3 lần. Kết quả của thí nghiệm là trung bình cộng của 3 lần thí nghiệm trên.
2.2.2. Quy trình dự kiến sản xuất bột protein từ đầu cá Ngừ
Quy trình dự kiến sản xuất dịch thủy phân từ đầu cá Ngừ bằng enzyme Protamex và Flavourzyme được thể hiện ở hình 2.6.
Đầu cá Ngừ
Nghiền nhỏ
Xác định thành phần hóa học
Hình 2.6. Sơ đồ quy trình dự kiến sản xuất dịch thủy phân đầu cá Ngừ
* Nguyên liệu
Đầu cá Ngừ vây vàng tươi, màu sắc tự nhiên, có mùi tanh tự nhiên, không có mùi lạ và không có dấu hiệu bị ươn hỏng.
* Xử lý
Xử lý
Thủy phân bằng enzyme Protamex Nghiền nhỏ
Lọc
Dầu Bã li tâm
Dịch thủy phân
Thủy phân bằng enzyme Flavourzyme
Bất hoạt enzyme
Li tâm Bã lọc
Nguyên liệu
Sấy phun
Vì kích thước đầu cá khá lớn nên cần phải chặt thành các miếng nhỏ để thuận tiện cho quá trình nghiền nhỏ.
* Nghiền nhỏ
Nguyên liệu sau khi xử lý đem nghiền nhỏ với các mức đường kính lỗ sàng là 3mm, nhằm tăng diện tích tiếp xúc, tạo điều kiện cho quá trình thủy phân diễn ra nhanh hơn. Sau đó cho nguyên liệu vào trong túi nhựa gồm các túi 100g, 500g để tiện cho quá trình thủy phân sau này, nếu không dùng ngay thì đem đi bảo quản ở nhiệt độ ≤-18oC cho đến khi sử dụng.
* Thủy phân ở giai đoạn đầu
Nguyên liệu được cho vào cốc thủy tinh, khối lượng mỗi mẫu 100g, tiến hành thủy phân ở giai đoạn đầu với các thông số: tỷ lệ nước/nguyên liệu: 1/1, pH tự nhiên, tỷ lệ enzyme/nguyên liệu, nhiệt độ thủy phân, thời gian thủy phân nhất định cho quá trình thủy phân bằng enzyme Protamex. Trong quá trình thủy phân, khuấy đảo thường xuyên, tạo điều kiện cho quá trình thủy phân diễn ra nhanh hơn, chính xác hơn. Kết thúc quá trình thủy phân bằng cách bất hoạt enzyme ở 90oC trong vòng 15 phút.
* Thủy phân ở giai đoạn sau
Sau khi thủy phân bằng enzyme Protamex, tiến hành thủy phân bằng enzyme Flavourzyme.
Nguyên liệu được cho vào cốc thủy tinh, cân khối lượng 100g, tiến hành thủy phân với các thông số: pH tự nhiên, tỷ lệ enzyme/nguyên liệu, nhiệt độ thủy phân, thời gian thủy phân nhất định cho quá trình thủy phân bằng enzyme Flavourzyme. Tiến hành khuấy đảo thường xuyên để tạo điều kiện cho quá trình thủy phân diễn ra nhanh hơn.
* Bất hoạt enzyme
Bất hoạt enzyme ở 900C trong vòng 15 phút, ngoài ra còn tiêu diệt vi sinh vật gây thối rữa, làm đông tụ protein để dễ dàng cho công đoạn sau.
* Lọc
* Ly tâm
Tiến hành ly tâm dịch lọc thu được trong thời gian 30 phút, tốc độ ly tâm 5000 vòng/phút. Ly tâm xong ta thu được 3 phần:
- Dịch thủy phân
- Dầu
- Phần cặn ly tâm * Sấy phun
Dịch thủy phân protein đã được phối trộn với maltodextrin theo tỷ lệ 10% sau đó đem sấy phun nhiệt độ sấy 1350C, tốc độ bơm 12ml/phút, áp suất khí nén 0,5 bar.
* Bột thủy phân protein
Bột thủy phân protein được bao gói hút chân không trong bao bì PA, bảo quản ở nhiệt độ 0-100C.
2.2.3. Bố trí thí nghiệm xác định các thông số thích hợp cho quá trình thủy phân
2.2.3.1. Bố trí thí nghiệm xác định các thông số thích hợp đối với enzyme Protamex ở giai đoạn đầu giai đoạn đầu
a) Bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ enzyme protamex/ nguyên liệu
Tiến hành thủy phân 5 mẫu từ đầu cá Ngừ đã xay nhuyễn, mỗi mẫu 100g nguyên liệu.
Hình 2.7. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ enzyme Protamex thích hợp
Thủy phân bằng enzyme Protamex (N/NL = 1/1, t=500C, pH tự nhiên, τ = 2giờ) Mẫu 1 (0,1%) Mẫu 3 (0,5%) Lọc
Xác định hiệu suất thu hồi Nitơ, Nitơ acid amin, Nitơ ammoniac
Mẫu 5 (0,9%) Mẫu 2 (0,3%) Mẫu 4 (0,7%) Chọn tỷ lệ enzyme Protamex thích hợp Dầu Bã li tâm Dịch thủy phân
Thủy phân bằng enzyme Flavourzyme (E/NL= 0,3%, t=500C, pH tự nhiên, τ = 2 giờ) Bất hoạt enzyme Li tâm Bã lọc Nguyên liệu Rã đông
- Giai đoạn đầu: Thủy phân với các tỷ lệ enzyme Protamex/nguyên liệu là: 0,1%, 0,3%, 0,5%, 0,7% và 0,9%. Thủy phân ở pH tự nhiên của cá, với các thông số cố định cho quá trình thủy phân bằng enzyme Protamex: nhiệt độ thủy phân là 500C, thời gian thủy phân là 2h, tỷ lệ nước/nguyên liệu là 1:1. Mẫu sau khi thủy phân làm bất hoạt enzyme ở nhiệt độ 900C trong thời gian 15 phút. Sau đó để nguội đến nhiệt độ khoảng 500C.
- Giai đoạn sau: Tiếp tục thủy phân bằng enzyme Flavourzyme với các thông số cố định (tỷ lệ enzyme/nguyên liệu: 0,3%, nhiệt độ thủy phân 500C, thời gian thủy phân 2 giờ, pH tự nhiên). Sau khi thủy phân, làm bất hoạt enzyme ở nhiệt độ 900C trong 15 phút, để nguội rồi tiếp tục lọc bỏ xương, hỗn hợp được ly tâm tách riêng thành 3 phần: dầu, dịch thủy phân, và phần cặn, dịch thủy phân được đem đi xác định Nitơ tổng số, Nitơ acid amin, Nitơ amoniac, hiệu suất thu hồi Nitơ.
Từ đó chọn tỷ lệ enzyme Protamex thích hợp.
b) Bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ thủy phân thích hợp đối với enzyme Protamex
Tiến hành thủy phân 5 mẫu từ đầu cá Ngừ đã xây nhuyễn, mỗi mẫu 100g nguyên liệu.
Hình 2.8. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ thủy phân thích hợp đối với Protamex
- Giai đoạn đầu: Thủy phân với các nhiệt độ thủy phân là: 400C, 450C, 500C, 550C, 600C. Thủy phân ở pH tự nhiên của cá, với các thông số cố định cho quá trình
Thủy phân bằng enzyme Protamex (N/NL = 1/1, E/NLopt, pH tự nhiên, τ = 2 giờ,)
Mẫu 1 (400C)
Mẫu 3 (500C)
Lọc
Xác định hiệu suất thu hồi Nitơ, Nitơ acid amin, Nitơ ammoniac
Mẫu 5 (600C) Mẫu 2 (450C) Mẫu 4 (550C)
Chọn nhiệt độ thủy phân thích hợp
Dầu
Bã li tâm Dịch thủy phân
Thủy phân bằng enzyme Flavourzyme (E/NL = 0,3%, t =500C, pH tự nhiên, τ = 2 giờ) Bất hoạt enzyme Li tâm Bã lọc Nguyên liệu Rã đông
thủy phân bằng enzyme Protamex: tỷ lệ enzyme/nguyên liệu đã xác định, thời gian thủy phân là 2h, tỷ lệ nước/nguyên liệu là 1:1. Mẫu sau khi thủy phân làm bất hoạt enzyme ở nhiệt độ 900C trong thời gian 15 phút. Sau đó để nguội đến nhiệt độ khoảng 500C.
- Giai đoạn sau: Tiếp tục thủy phân bằng enzyme Flavourzyme với các thông số cố định (tỷ lệ enzyme/nguyên liệu: 0,3%, nhiệt độ thủy phân 500C, thời gian thủy phân 2 giờ, pH tự nhiên). Sau khi thủy phân, làm bất hoạt enzyme ở nhiệt độ 900C trong 15 phút, để nguội rồi tiếp tục lọc bỏ xương, hỗn hợp được ly tâm tách riêng thành 3 phần: dầu, dịch thủy phân, và phần cặn, dịch thủy phân được đem đi xác định Nitơ tổng số, Nitơ acid amin, Nitơ amoniac, hiệu suất thu hồi Nitơ.
Từ đó chọn nhiệt độ thủy phân thích hợp đối với enzyme Protamex
c) Bố trí thí nghiệm xác định thời gian thủy phân thích hợp đối với enzyme Protamex
Tiến hành thủy phân 6 mẫu từ đầu cá Ngừ đã xây nhuyễn, mỗi mẫu 100g nguyên liệu.
Hình 2.9. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian thủy phân thích hợp đối với Protamex
- Giai đoạn đầu: Thủy phân với thời gian thủy phân là: 1 giờ, 2 giờ, 3 giờ, 4 giờ, 5 giờ, 6 giờ. Thủy phân ở pH tự nhiên của cá, với các thông số cố định cho quá trình thủy phân bằng enzyme Protamex: tỷ lệ enzyme/nguyên liệu đã xác định, nhiệt
Thủy phân bằng enzyme Protamex (N/NL = 1/1, E/NLopt, t0opt, pH tự nhiên)
Mẫu 1 (1 giờ)
Mẫu 4 (4 giờ)
Lọc
Xác định hiệu suất thu hồi Nitơ, Nitơ acid amin, Nitơ ammoniac
Mẫu 6 (6 giờ) Mẫu 3 (3 giờ) Mẫu 5 (5 giờ)
Chọn thời gian thủy phân thích hợp
Dầu
Bã li tâm Dịch thủy phân
Thủy phân bằng enzyme Flavourzyme (E/NL 0,3%, t=500C, τ = 2 giờ, pH tự nhiên) Bất hoạt enzyme Li tâm Bã lọc Nguyên liệu Rã đông Mẫu 2 (2 giờ)
độ thủy phân đã xác định, tỷ lệ nước/nguyên liệu là 1:1. Mẫu sau khi thủy phân làm bất hoạt enzyme ở nhiệt độ 900C trong thời gian 15 phút. Sau đó để nguội đến nhiệt độ khoảng 500C.
- Giai đoạn sau: Tiếp tục thủy phân bằng enzyme Flavourzyme với các thông số cố định (tỷ lệ enzyme/nguyên liệu: 0,3%, nhiệt độ thủy phân 500C, thời gian thủy phân 2 giờ, pH tự nhiên). Sau khi thủy phân, làm bất hoạt enzyme ở nhiệt độ 900C trong 15 phút, để nguội rồi tiếp tục lọc bỏ xương, hỗn hợp được ly tâm tách riêng thành 3 phần: dầu, dịch thủy phân, và phần cặn, dịch thủy phân được đem đi xác định Nitơ tổng số, Nitơ acid amin, Nitơ amoniac, hiệu suất thu hồi Nitơ.
Từ đó chọn thời gian thủy phân thích hợp đối với enzyme Protamex.
2.2.3.2. Bố trí thí nghiệm xác định các thông số thích hợp đối với enzyme Flavourzyme ở giai đoạn sau ở giai đoạn sau
Sau khi đã xác định các thông số thích hợp cho quá trình thủy phân đầu cá Ngừ bằng enzyme Protamex, tiến hành xác định các thông số thích hợp cho quá trỉnh thủy phân bằng enzyme Flavourzyme ở giai đoạn sau.
a) Bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ enzyme Flavourzyme/nguyên liệu
Tiến hành thủy phân 5 mẫu từ đầu cá Ngừ đã xây nhuyễn, mỗi mẫu 100g nguyên liệu.
Hình 2.10. Bố trí thí nghiệm xác định thích hợp tỷ lệ enzyme Flavourzyme/nguyên liệu thích hợp
Thủy phân bằng enzyme Protamex (N/NL = 1/1, E/NLopt, t0opt, τ opt, pH tự nhiên)
Lọc
Xác định hiệu suất thu hồi Nitơ, Nitơ acid amin, Nitơ ammoniac
Chọn tỷ lệ enzyme Flavourzyme/nguyên liệu thích hợp
Dầu
Bã li tâm Dịch thủy phân
Thủy phân bằng enzyme Flavourzyme (t0= 500C, τ = 2 giờ, pH tự nhiên) Bất hoạt enzyme Li tâm Bã lọc Mẫu 1 (0,1%) Mẫu 3 (0,5%) Mẫu 5 (0,9%) Mẫu 2 (0,3%) Mẫu 4 (0,7%) Nguyên liệu Rã đông
- Giai đoạn đầu: Thủy phân bằng enzyme Protamex với các thông số thích hợp đã xác định (enzyme/nguyên liệu, nhiệt độ thủy phân, tỷ lệ nước/nguyên liệu là 1:1, pH tự nhiên). Mẫu sau khi thủy phân làm bất hoạt enzyme ở nhiệt độ 900C trong thời gian 15 phút. Sau đó để nguội đến nhiệt độ khoảng 500C.
- Giai đoạn sau: Tiếp tục thủy phân bằng enzyme Flavourzyme với các tỷ lệ enzyme Flavourzyme/nguyên liệu: 0,1%, 0,3%, 0,5%, 0,7%, 0,9%, nhiệt độ thủy phân 500C, thời gian thủy phân 2 giờ, pH tự nhiên. Sau khi thủy phân, làm bất hoạt enzyme ở nhiệt độ 900C trong 15 phút, để nguội rồi tiếp tục lọc bỏ xương, hỗn hợp được ly tâm tách riêng thành 3 phần: dầu, dịch thủy phân, và phần cặn, dịch thủy phân được đem đi xác định Nitơ tổng số, Nitơ acid amin, Nitơ amoniac, hiệu suất thu hồi Nitơ.
Từ đó chọn tỷ lệ enzyme Flavourzyme/nguyên liệu thích hợp
b) Bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ thủy phân thích hợp đối với enzyme Flavourzyme Flavourzyme
Tiến hành thủy phân 5 mẫu từ đầu cá Ngừ đã xây nhuyễn, mỗi mẫu 100g nguyên liệu.
Hình 2.11. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ thủy phân thích hợp
- Giai đoạn đầu: Thủy phân bằng enzyme Protamex với các thông số thích hợp đã xác định (enzyme/nguyên liệu, nhiệt độ thủy phân, tỷ lệ nước/nguyên liệu là 1:1,
Thủy phân bằng enzyme Protamex (E/NLopt, t0opt, N/NL = 1/1, pH tự nhiên, τ opt)
Lọc
Xác định hiệu suất thu hồi Nitơ, Nitơ acid amin, Nitơ ammoniac
Chọn nhiệt độ thủy phân thích hợp
Dầu
Bã li tâm Dịch thủy phân
Thủy phân bằng enzyme Flavourzyme (E/NLopt, τ = 2 giờ, pH tự nhiên)
Bất hoạt enzyme Li tâm Bã lọc Mẫu 1 (400C) Mẫu 3 (500C) Mẫu 5 (600C) Mẫu 2 (450C) Mẫu 4 (550C) Nguyên liệu Rã đông
pH tự nhiên). Mẫu sau khi thủy phân làm bất hoạt enzyme ở nhiệt độ 900C trong thời gian 15 phút. Sau đó để nguội.
- Giai đoạn sau: Tiếp tục thủy phân bằng enzyme Flavourzyme với nhiệt độ thủy phân tương ứng: 400C, 450C, 500C, 550C, 600C, tỷ lệ enzyme Flavourzyme/nguyên liệu đã xác định, thời gian thủy phân 2 giờ, pH tự nhiên. Sau khi thủy phân, làm bất hoạt enzyme ở nhiệt độ 900C trong 15 phút, để nguội rồi tiếp tục lọc bỏ xương, hỗn hợp được ly tâm tách riêng thành 3 phần: dầu, dịch thủy phân, và phần cặn, dịch thủy phân được đem đi xác định Nitơ tổng số, Nitơ acid amin, Nitơ amoniac, hiệu suất thu hồi Nitơ.
Từ đó chọn nhiệt độ thủy phân thích hợp đối với enzyme Flavourzyme.
c) Bố trí thí nghiệm xác định thời gian thủy phân thích hợp đối với enzyme Flavourzyme
Tiến hành thủy phân 5 mẫu từ đầu cá Ngừ đã xây nhuyễn, mỗi mẫu 100g nguyên liệu.
Hình 2.12. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian thủy phân thích hợp
- Giai đoạn đầu: Thủy phân bằng enzyme Protamex với các thông số thích hợp đã xác định (enzyme/nguyên liệu, nhiệt độ thủy phân, tỷ lệ nước/nguyên liệu là 1:1,
Thủy phân bằng enzyme Protamex (N/NL = 1/1, E/NLopt, t0opt, pH tự nhiên, τ opt)
Lọc
Xác định hiệu suất thu hồi Nitơ, Nitơ acid amin, Nitơ ammoniac
Chọn thời gian thủy phân thích hợp
Dầu
Bã li tâm Dịch thủy phân
Thủy phân bằng enzyme Flavourzyme (E/NLopt, t0opt, pH tự nhiên)
Bất hoạt enzyme Li tâm Bã lọc Mẫu 1 (1 giờ) Mẫu 3 (3 giờ) Mẫu 5 (5 giờ) Mẫu 2 (2 giờ) Mẫu 4 (4 giờ) Nguyên liệu Rã đông
pH tự nhiên). Mẫu sau khi thủy phân làm bất hoạt enzyme ở nhiệt độ 900C trong thời gian 15 phút. Sau đó để nguội.
- Giai đoạn sau: Tiếp tục thủy phân bằng enzyme Flavourzyme với thời gian thủy phân tương ứng: 1 giờ, 2 giờ, 3 giờ, 4 giờ, 5 giờ, tỷ lệ enzyme Flavourzyme/nguyên liệu đã xác định, nhiệt độ thủy phân đã xác định, pH tự nhiên. Sau khi thủy phân, làm bất hoạt enzyme ở nhiệt độ 900C trong 15 phút, để nguội rồi tiếp tục lọc bỏ xương, hỗn hợp được ly tâm tách riêng thành 3 phần: dầu, dịch thủy phân, và phần cặn, dịch thủy phân được đem đi xác định Nitơ tổng số, Nitơ acid amin, Nitơ amoniac, hiệu suất thu hồi Nitơ.
Từ đó chọn thời gian thủy phân thích hợp đối với enzyme Flavourzyme.
2.3. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 2.3.1. Phương pháp phân tích 2.3.1. Phương pháp phân tích
- Xác định hàm lượng nước bằng phương pháp sấy ở 100–1050C (theo TCVN 3700 – 90). - Xác định hàm lượng tro toàn phần bằng phương pháp nung ở 550–6000C (theo TCVN 5105 – 90).
- Xác định hàm lượng protein tổng số bằng phương pháp Kjeldahl (theo TCVN