1. 2.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình thủyphân
1.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nước
Vũ Ngọc Bội (2004) đã nghiên cứu quá trình thủy phân cá bằng enzyme protease từ B.subtilis S5. Chế phẩm protease kỹ thuật này có nhiệt độ thích hợp là
550C, pH thích hợp là 6,0 và có thể sử dụng rất tốt trong thủy phân cơ thịt cá tạp để sản xuất bột đạm thủy phân và thủy phân cá cơm trong sản xuất nước mắm ngắn ngày [4].
Nguyễn Thị Mỹ Hương (2011) đã nghiên cứu sản xuất sản phẩm thủy phân protein từ đầu cá Ngừ vây vàng và sử dụng sản phẩm thủy phân này trong thức ăn cho tôm. Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng, việc bổ sung bột protein thủy phân từ đầu cá ngừ vào trong thức ăn cho tôm đã cải thiện sự tăng khối lượng của tôm, hệ số chuyển hóa thức ăn và hiệu quả sử dụng protein [6].
Lý Thị Minh Phương (năm 2008) đã nghiên cứu sản xuất dịch thủy phân từ thịt Hàu biển dùng trong thực phẩm. Kết quả nghiên cứu cho thấy dịch thủy phân thu được có hàm lượng axít amin cao, mùi thơm và đạt tiêu chuẩn về vi sinh với loại
enzyme thủy phân thích hợp là Allzyme FD ở nồng độ enzyme so với cơ chất là 0,32%, nhiệt độ 560C, pH= 6,5, thời gian thủy phân là 8 giờ [11].
Trần Thị Hồng Nghi và cộng sự (2011) đã nghiên cứu sử dụng enzyme protease từ vi khuẩn (Bacillus subtilis) để thủy phân phụ phẩm cá tra và ứng dụng sản phẩm thủy phân trong việc sản xuất nước mắm. Điều kiện tối ưu cho việc thủy phân phụ phẩm cá Tra bằng enzyme protease từ vi khuẩn Bacillus subtilis như sau: nhiệt độ 500C, pH = 7,6; tỷ lệ nước 30%, nồng độ muối 2%, hoạt độ enzyme 50UI và thời gian thủy phân là 18 giờ. Sản phẩm nước mắm thu được sau khi ủ ở tỷ lệ bã chượp 20% có hàm lượng đạm formol 14,5g/l, đạm tổng số 16g/l, đạm NH3 1,49g/l và axid amin 12,81g/l [9].
Huỳnh Dự (2010) đã nghiên cứu quá trình thủy phân phế liệu mực bằng enzyme protease và thử nghiệm bổ sung dịch thủy phân vào thức ăn nuôi cá. Kết quả chỉ ra rằng qua ba loại enzyme Alcalase, Protamex và Neutrase sử dụng thủy phân phế liệu mực thì Alcalase hiệu quả hơn so với hai loại enzyme còn lại. Điều kiện thích hợp nhất với enzyme Alcalase là nồng độ enzyme là 5% so với trọng lượng chất khô của phế liệu mực, pH = 7,6, nhiệt độ 530C, thời gian thủy phân 2 giờ [5].
Nguyễn Thị Ngọc Hoài (2012) đã nghiên cứu thu hồi và đặc trưng hóa tính chất sản phẩm thủy phân protein từ đầu tôm bằng enzyme. Kết quả dịch thủy phân protein thu được đem cô quay ở nhiệt độ 450C, áp suất hút chân không là 50 mbar, thời gian hút là 20 phút, nồng độ chất khô trong dịch thủy phân sau cô quay là 220Brix. Sau đó, tiến hành sấy phun dịch cô quay ở nhiệt độ 1300C, nồng độ maltodextrin bổsung là 8%, mẫu thu được có độ ẩm là 10% , trong 1 gam bột thì hàm lượng protein hòa tan là 110,1mg [10].
Qua những nghiên cứu và thực trạng ngành thủy sản trong nước và trên thế giới, thì vấn đề tận dụng nguồn nguyên liệu còn lại từ các quá trình chế biến thủy sản, cụ thể là đầu cá Ngừ chưa được chú trọng khai thác triệt để. Vì vậy việc nghiên cứu quá trình thủy phân đầu cá ngừ là cần thiết góp phần tăng thêm một hướng nghiên cứu mới và ứng dụng cho thực tiễn đời sống, phấn đấu đạt mục tiêu phát triển bền vững trong ngành thủy sản nói riêng và ngành công nghiệp thực phẩm nói chung
CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
2.1.1. Cá Ngừ vây vàng, đầu cá Ngừ vây vàng
Cá Ngừ vây vàng [36]:
Tên tiếng anh: Yellowfin tuna Phân loại khoa học
Hình 2.1. Cá ngừ vây vàng
Giới (regnum): Animalia Ngành (phylum): Chordata
Lớp (class): Actinopterygii Bộ (ordo): Perciformes Họ (familia): Scombridae Chi (genus): Thunnus
Đầu cá ngừ vây vàng:
Hình 2.2. Đầu cá Ngừ vây vàng
Hình 2.2. Đầu cá Ngừ vây vàng
Đầu cá ngừ vây vàng được lấy tại công ty TNHH JK Fish, địa chỉ 49 tổ 21- hòn Nghê 1, Vĩnh Ngọc, Nha Trang. Sau đó đầu cá được đem về phòng thí nghiệm công nghệ chế biến cắt thành từng khúc nhỏ, xay nhuyễn.
Hình 2.3. Đầu cá Ngừvây vàng đã được xay nhuyễn
Mẫu cá xay nhuyễn được cho vào các túi PE khối lượng 100g và 500g, sau đó đem bảo quản ở nhiệt độ -18 ÷ -200C cho đến khi sử dụng.
2.1.2. Enzyme Protamex và Flavourzyme 2.1.2.1. Enzyme Protamex 2.1.2.1. Enzyme Protamex
Enzyme Protamex có nguồn vật Bacillus của Novozyme (Đan mạch). Nó được sản xuất để thủy phân protein của thực phẩm. Hiện nay enzyme này đang được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu và thực tiễn sản xuất [28]
Enzyme Protamex có hoạt độ 1,5 AU/g, Hoạt động thích hợp trong khoảng pH = 5,5 – 7,5; nhiệt độ 350C – 600C. Protamex bị mất hoạt tính trong 30 phút ở 500C khi pH = 4 và trong 10 phút tại 850C hoặc cao hơn [28].
2.1.2.2 Enzyme Flavourzyme
Enzyme Flavourzyme: là một protease được chiết xuất từ nấm Aspergillus oryzae. Hỗn hợp enzyme này có nhiệt độ hoạt động ở 40oC ÷ 60oC, hoạt động thích hợp ở nhiệt độ 40oC ÷ 60oC, pH hoạt động nằm trong khoảng 5,0 ÷ 7,0 [29].
Chế phẩm này của hãng Novozymes sản xuất và đã được tổ chức FAO cho phép sử dụng trong thực phẩm. Nó bao gồm tính chất của một endoprotease và exoprotease. Enzyme này bị bất hoạt ở 85oC trong 10 phút hoặc cao hơn. Tuy nhiên, sự khử hoạt tính của Flavourzyme phụ thuộc nhiều vào cơ chất, điều kiện môi trường hoạt động (nồng độ cơ chất, pH …) [29].
Hiện nay, Flavourzyme thường được ứng dụng trên thực tế, dùng để thủy phân protein trong thực phẩm. Hoạt độ của nó là 500 LAPU/g (Leucine Amino Peptidase). 1LAPU là lượng enzyme cần để thủy phân 1 µmol of L-leucine- pnitroanilide trong 1 phút [29].
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Xác định thành phần hóa học của phế liệu đầu cá ngừ
Hình 2.4. Sơ đồxác định thành phần hóa học của đầu cá Ngừ
Tiến hành cân khối lượng đầu cá ngừ đã chuẩn bị từ trước đem đi xác định thành phần hóa học: hàm lượng nước, lipid, protein, khoáng tan trong HCl. Mỗi thành phần hóa học lặp lại 3 lần. Kết quả của thí nghiệm là trung bình cộng của 3 lần thí nghiệm trên.
2.2.2. Quy trình dự kiến sản xuất bột protein từ đầu cá Ngừ
Quy trình dự kiến sản xuất dịch thủy phân từ đầu cá Ngừ bằng enzyme Protamex và Flavourzyme được thể hiện ở hình 2.6.
Đầu cá Ngừ
Nghiền nhỏ
Xác định thành phần hóa học
Hình 2.6. Sơ đồ quy trình dự kiến sản xuất dịch thủy phân đầu cá Ngừ
* Nguyên liệu
Đầu cá Ngừ vây vàng tươi, màu sắc tự nhiên, có mùi tanh tự nhiên, không có mùi lạ và không có dấu hiệu bị ươn hỏng.
* Xử lý
Xử lý
Thủy phân bằng enzyme Protamex Nghiền nhỏ
Lọc
Dầu Bã li tâm
Dịch thủy phân
Thủy phân bằng enzyme Flavourzyme
Bất hoạt enzyme
Li tâm Bã lọc
Nguyên liệu
Sấy phun
Vì kích thước đầu cá khá lớn nên cần phải chặt thành các miếng nhỏ để thuận tiện cho quá trình nghiền nhỏ.
* Nghiền nhỏ
Nguyên liệu sau khi xử lý đem nghiền nhỏ với các mức đường kính lỗ sàng là 3mm, nhằm tăng diện tích tiếp xúc, tạo điều kiện cho quá trình thủy phân diễn ra nhanh hơn. Sau đó cho nguyên liệu vào trong túi nhựa gồm các túi 100g, 500g để tiện cho quá trình thủy phân sau này, nếu không dùng ngay thì đem đi bảo quản ở nhiệt độ ≤-18oC cho đến khi sử dụng.
* Thủy phân ở giai đoạn đầu
Nguyên liệu được cho vào cốc thủy tinh, khối lượng mỗi mẫu 100g, tiến hành thủy phân ở giai đoạn đầu với các thông số: tỷ lệ nước/nguyên liệu: 1/1, pH tự nhiên, tỷ lệ enzyme/nguyên liệu, nhiệt độ thủy phân, thời gian thủy phân nhất định cho quá trình thủy phân bằng enzyme Protamex. Trong quá trình thủy phân, khuấy đảo thường xuyên, tạo điều kiện cho quá trình thủy phân diễn ra nhanh hơn, chính xác hơn. Kết thúc quá trình thủy phân bằng cách bất hoạt enzyme ở 90oC trong vòng 15 phút.
* Thủy phân ở giai đoạn sau
Sau khi thủy phân bằng enzyme Protamex, tiến hành thủy phân bằng enzyme Flavourzyme.
Nguyên liệu được cho vào cốc thủy tinh, cân khối lượng 100g, tiến hành thủy phân với các thông số: pH tự nhiên, tỷ lệ enzyme/nguyên liệu, nhiệt độ thủy phân, thời gian thủy phân nhất định cho quá trình thủy phân bằng enzyme Flavourzyme. Tiến hành khuấy đảo thường xuyên để tạo điều kiện cho quá trình thủy phân diễn ra nhanh hơn.
* Bất hoạt enzyme
Bất hoạt enzyme ở 900C trong vòng 15 phút, ngoài ra còn tiêu diệt vi sinh vật gây thối rữa, làm đông tụ protein để dễ dàng cho công đoạn sau.
* Lọc
* Ly tâm
Tiến hành ly tâm dịch lọc thu được trong thời gian 30 phút, tốc độ ly tâm 5000 vòng/phút. Ly tâm xong ta thu được 3 phần:
- Dịch thủy phân
- Dầu
- Phần cặn ly tâm * Sấy phun
Dịch thủy phân protein đã được phối trộn với maltodextrin theo tỷ lệ 10% sau đó đem sấy phun nhiệt độ sấy 1350C, tốc độ bơm 12ml/phút, áp suất khí nén 0,5 bar.
* Bột thủy phân protein
Bột thủy phân protein được bao gói hút chân không trong bao bì PA, bảo quản ở nhiệt độ 0-100C.
2.2.3. Bố trí thí nghiệm xác định các thông số thích hợp cho quá trình thủy phân
2.2.3.1. Bố trí thí nghiệm xác định các thông số thích hợp đối với enzyme Protamex ở giai đoạn đầu giai đoạn đầu
a) Bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ enzyme protamex/ nguyên liệu
Tiến hành thủy phân 5 mẫu từ đầu cá Ngừ đã xay nhuyễn, mỗi mẫu 100g nguyên liệu.
Hình 2.7. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ enzyme Protamex thích hợp
Thủy phân bằng enzyme Protamex (N/NL = 1/1, t=500C, pH tự nhiên, τ = 2giờ) Mẫu 1 (0,1%) Mẫu 3 (0,5%) Lọc
Xác định hiệu suất thu hồi Nitơ, Nitơ acid amin, Nitơ ammoniac
Mẫu 5 (0,9%) Mẫu 2 (0,3%) Mẫu 4 (0,7%) Chọn tỷ lệ enzyme Protamex thích hợp Dầu Bã li tâm Dịch thủy phân
Thủy phân bằng enzyme Flavourzyme (E/NL= 0,3%, t=500C, pH tự nhiên, τ = 2 giờ) Bất hoạt enzyme Li tâm Bã lọc Nguyên liệu Rã đông
- Giai đoạn đầu: Thủy phân với các tỷ lệ enzyme Protamex/nguyên liệu là: 0,1%, 0,3%, 0,5%, 0,7% và 0,9%. Thủy phân ở pH tự nhiên của cá, với các thông số cố định cho quá trình thủy phân bằng enzyme Protamex: nhiệt độ thủy phân là 500C, thời gian thủy phân là 2h, tỷ lệ nước/nguyên liệu là 1:1. Mẫu sau khi thủy phân làm bất hoạt enzyme ở nhiệt độ 900C trong thời gian 15 phút. Sau đó để nguội đến nhiệt độ khoảng 500C.
- Giai đoạn sau: Tiếp tục thủy phân bằng enzyme Flavourzyme với các thông số cố định (tỷ lệ enzyme/nguyên liệu: 0,3%, nhiệt độ thủy phân 500C, thời gian thủy phân 2 giờ, pH tự nhiên). Sau khi thủy phân, làm bất hoạt enzyme ở nhiệt độ 900C trong 15 phút, để nguội rồi tiếp tục lọc bỏ xương, hỗn hợp được ly tâm tách riêng thành 3 phần: dầu, dịch thủy phân, và phần cặn, dịch thủy phân được đem đi xác định Nitơ tổng số, Nitơ acid amin, Nitơ amoniac, hiệu suất thu hồi Nitơ.
Từ đó chọn tỷ lệ enzyme Protamex thích hợp.
b) Bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ thủy phân thích hợp đối với enzyme Protamex
Tiến hành thủy phân 5 mẫu từ đầu cá Ngừ đã xây nhuyễn, mỗi mẫu 100g nguyên liệu.
Hình 2.8. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ thủy phân thích hợp đối với Protamex
- Giai đoạn đầu: Thủy phân với các nhiệt độ thủy phân là: 400C, 450C, 500C, 550C, 600C. Thủy phân ở pH tự nhiên của cá, với các thông số cố định cho quá trình
Thủy phân bằng enzyme Protamex (N/NL = 1/1, E/NLopt, pH tự nhiên, τ = 2 giờ,)
Mẫu 1 (400C)
Mẫu 3 (500C)
Lọc
Xác định hiệu suất thu hồi Nitơ, Nitơ acid amin, Nitơ ammoniac
Mẫu 5 (600C) Mẫu 2 (450C) Mẫu 4 (550C)
Chọn nhiệt độ thủy phân thích hợp
Dầu
Bã li tâm Dịch thủy phân
Thủy phân bằng enzyme Flavourzyme (E/NL = 0,3%, t =500C, pH tự nhiên, τ = 2 giờ) Bất hoạt enzyme Li tâm Bã lọc Nguyên liệu Rã đông
thủy phân bằng enzyme Protamex: tỷ lệ enzyme/nguyên liệu đã xác định, thời gian thủy phân là 2h, tỷ lệ nước/nguyên liệu là 1:1. Mẫu sau khi thủy phân làm bất hoạt enzyme ở nhiệt độ 900C trong thời gian 15 phút. Sau đó để nguội đến nhiệt độ khoảng 500C.
- Giai đoạn sau: Tiếp tục thủy phân bằng enzyme Flavourzyme với các thông số cố định (tỷ lệ enzyme/nguyên liệu: 0,3%, nhiệt độ thủy phân 500C, thời gian thủy phân 2 giờ, pH tự nhiên). Sau khi thủy phân, làm bất hoạt enzyme ở nhiệt độ 900C trong 15 phút, để nguội rồi tiếp tục lọc bỏ xương, hỗn hợp được ly tâm tách riêng thành 3 phần: dầu, dịch thủy phân, và phần cặn, dịch thủy phân được đem đi xác định Nitơ tổng số, Nitơ acid amin, Nitơ amoniac, hiệu suất thu hồi Nitơ.
Từ đó chọn nhiệt độ thủy phân thích hợp đối với enzyme Protamex
c) Bố trí thí nghiệm xác định thời gian thủy phân thích hợp đối với enzyme Protamex
Tiến hành thủy phân 6 mẫu từ đầu cá Ngừ đã xây nhuyễn, mỗi mẫu 100g nguyên liệu.
Hình 2.9. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian thủy phân thích hợp đối với Protamex
- Giai đoạn đầu: Thủy phân với thời gian thủy phân là: 1 giờ, 2 giờ, 3 giờ, 4 giờ, 5 giờ, 6 giờ. Thủy phân ở pH tự nhiên của cá, với các thông số cố định cho quá trình thủy phân bằng enzyme Protamex: tỷ lệ enzyme/nguyên liệu đã xác định, nhiệt
Thủy phân bằng enzyme Protamex (N/NL = 1/1, E/NLopt, t0opt, pH tự nhiên)
Mẫu 1 (1 giờ)
Mẫu 4 (4 giờ)
Lọc
Xác định hiệu suất thu hồi Nitơ, Nitơ acid amin, Nitơ ammoniac
Mẫu 6 (6 giờ) Mẫu 3 (3 giờ) Mẫu 5 (5 giờ)
Chọn thời gian thủy phân thích hợp
Dầu
Bã li tâm Dịch thủy phân
Thủy phân bằng enzyme Flavourzyme (E/NL 0,3%, t=500C, τ = 2 giờ, pH tự nhiên) Bất hoạt enzyme Li tâm Bã lọc Nguyên liệu Rã đông Mẫu 2 (2 giờ)
độ thủy phân đã xác định, tỷ lệ nước/nguyên liệu là 1:1. Mẫu sau khi thủy phân làm bất hoạt enzyme ở nhiệt độ 900C trong thời gian 15 phút. Sau đó để nguội đến nhiệt độ khoảng 500C.
- Giai đoạn sau: Tiếp tục thủy phân bằng enzyme Flavourzyme với các thông số cố định (tỷ lệ enzyme/nguyên liệu: 0,3%, nhiệt độ thủy phân 500C, thời gian thủy phân 2 giờ, pH tự nhiên). Sau khi thủy phân, làm bất hoạt enzyme ở nhiệt độ 900C trong 15 phút, để nguội rồi tiếp tục lọc bỏ xương, hỗn hợp được ly tâm tách riêng thành 3 phần: dầu, dịch thủy phân, và phần cặn, dịch thủy phân được đem đi xác định Nitơ tổng số, Nitơ acid amin, Nitơ amoniac, hiệu suất thu hồi Nitơ.
Từ đó chọn thời gian thủy phân thích hợp đối với enzyme Protamex.
2.2.3.2. Bố trí thí nghiệm xác định các thông số thích hợp đối với enzyme Flavourzyme ở giai đoạn sau ở giai đoạn sau
Sau khi đã xác định các thông số thích hợp cho quá trình thủy phân đầu cá Ngừ bằng enzyme Protamex, tiến hành xác định các thông số thích hợp cho quá trỉnh thủy phân bằng enzyme Flavourzyme ở giai đoạn sau.
a) Bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ enzyme Flavourzyme/nguyên liệu
Tiến hành thủy phân 5 mẫu từ đầu cá Ngừ đã xây nhuyễn, mỗi mẫu 100g nguyên liệu.
Hình 2.10. Bố trí thí nghiệm xác định thích hợp tỷ lệ enzyme Flavourzyme/nguyên liệu thích hợp
Thủy phân bằng enzyme Protamex (N/NL = 1/1, E/NLopt, t0opt, τ opt, pH tự nhiên)
Lọc
Xác định hiệu suất thu hồi Nitơ, Nitơ acid amin, Nitơ ammoniac
Chọn tỷ lệ enzyme Flavourzyme/nguyên liệu thích hợp
Dầu
Bã li tâm Dịch thủy phân
Thủy phân bằng enzyme Flavourzyme (t0= 500C, τ = 2 giờ, pH tự nhiên) Bất hoạt enzyme Li tâm Bã lọc Mẫu 1 (0,1%) Mẫu 3 (0,5%) Mẫu 5 (0,9%) Mẫu 2 (0,3%) Mẫu 4 (0,7%) Nguyên liệu Rã đông
- Giai đoạn đầu: Thủy phân bằng enzyme Protamex với các thông số thích hợp đã xác định (enzyme/nguyên liệu, nhiệt độ thủy phân, tỷ lệ nước/nguyên liệu là 1:1,