1.2.1. Quá trình ôxy hóa
Sự ôxy hóa là một qúa trình sinh hóa xảy ra trong cơ thể sinh ra các gốc tự do khi có mặt của ôxy phân tử.
Hình 1.7. Gốc tự do
Theo định nghĩa, gốc tự do (Free radical) là bất cứ phân tử hóa chất nào chỉ có một điện tử duy nhất (electron mang điện âm) hay một số lẻ điện tử.
Đôi khi, trong diễn tiến hóa học, một điện tử bị tách rời khỏi nhóm và phân tử đó trở thành một gốc tự do, với số lẻ điện tử. Do đó, nó không cân bằng, đầy đủ nên rất bất ổn, dễ tạo ra phản ứng. Nó luôn luôn tìm cách chiếm đoạt điện tử mà nó thiếu từ các phân tử khác, và lần lượt tạo ra một chuỗi những gốc tự do mới, gây rối loạn cho sinh hoạt bình thường của tế bào.
Chính do chứa điện độc thân mà gốc tự do có hoạt tính rất mạnh, nó luôn sẵn sàng thực hiện oxy hoá, nhận điện tử của chất mà nó tiếp xúc (để ghép đôi với điện tử độc thân của nó) và làm chất bị nó ôxy hoá bị huỷ hoại nặng nề.
Năm 1954, bác sĩ Denham Harman thuộc Đại học Berkeley, California [24], là khoa học gia đầu tiên nhận ra sự hiện hữu của gốc tự do trong cơ thể với nguy cơ gây ra những tổn thương cho tế bào. Trước đó, người ta cho rằng gốc tự do này chỉ có ở ngoài cơ thể.
Tia tử ngoại, môi trường ô nhiễm, stress, chất phụ gia trong thức ăn, các chất có hại trong mỹ phẩm, thuốc lá, uống rượu quá đà, lạm dụng dược phẩm… là những tác nhân chính gây ra gốc tự do.
Hình 1.8. Nguồn gốc hình thành gốc tự do
Gốc tự do có tác dụng không tốt cho cơ thể liên tục ngay từ lúc con người mới sinh ra và mỗi tế bào chịu sự tấn công của cả chục nghìn gốc tự do mỗi ngày. Ở tuổi trung niên, cơ thể mạnh, trấn áp được chúng, nhưng tới tuổi cao, sức yếu, gốc tự do lấn át, gây thiệt hại nhiều gấp mười lần ở người trẻ. Nếu không bị kiểm soát, kiềm chế, gốc tự do gây ra các bệnh thoái hóa như ung thư, xơ cứng động mạch, làm suy yếu hệ thống miễn dịch gây dễ bị nhiễm trùng, làm giảm trí tuệ, teo cơ quan bộ phận người cao niên.
Nó phá rách màng tế bào khiến chất dinh dường thất thoát, tế bào không tăng trưởng, tu bổ, rồi chết. Nó tạo ra chất lipofuscin tích tụ dưới da khiến ta có những vết đồi mồi trên mặt, trên mu bàn tay. Nó tiêu hủy hoặc ngăn cản sự tổng hợp các phân tử chất đạm, đường bột, mỡ, enzyme trong tế bào. Nó gây đột biến ở gene, ở nhiễm thể, ở DNA, RNA. Nó làm chất collagen, elastin mất đàn tính, dẻo dai khiến da nhăn nheo, cơ khớp cứng nhắc.
Theo các nhà nghiên cứu, gốc tự do hủy hoại tế bào theo diễn tiến sau đây: Trước hết, gốc tự do oxy hóa màng tế bào, gây trở ngại trong việc thải chất bã và
tiếp nhận thực phẩm, dưỡng khí; rồi gốc tự do tấn công các ty lập thể, phá vỡ nguồn cung cấp năng lượng. Sau cùng, bằng cách oxy hóa, gốc tự do làm suy yếu kích thích tố, enzym khiến cơ thể không tăng trưởng được.
Trong tiến trình hóa già, gốc tự do cũng dự phần và có thể là nguy cơ gây tử vong. Hóa già được coi như một tích tụ những đổi thay trong mô và tế bào. Theo bác sĩ Denham Harman[24], các gốc tự do là một trong nhiều nguyên nhân gây ra sự hoá già và sự chết cuả các sinh vật. Ông cho rằng gốc tự do phản ứng lên ty lạp thể, gây tổn thương các phân tử bằng cách làm thay đổi hình dạng, cấu trúc, khiến chúng trở nên bất khiển dụng, mất khả năng sản xuất năng lượng.
Do quan sát, người ta thấy gốc tự do có ít ở các sinh vật chết non, có nhiều hơn ở sinh vật sống lâu. Người cao tuổi có nhiều gốc tự hơn là khi người đó còn trẻ. Theo các nhà khoa học thì gốc tự do có thể là thủ phạm gây ra tới trên 60 bệnh, đáng kể nhất gồm có: bệnh xơ vữa động mạch, ung thư, Alzheimer, Parkinson, đục thuỷ tinh thể, bệnh tiểu đường, cao huyết áp không nguyên nhân, xơ gan.
Tuy nhiên, không phải là gốc tự do nào cũng phá hoại. Đôi khi chúng cũng có một vài hành động hữu ích. Nếu được kiềm chế, nó là nguồn cung cấp năng lượng cho cơ thể; tạo ra chất mầu melanine cần cho thị giác; góp phần sản xuất prostaglandins có công dụng ngừa nhiễm trùng; tăng cường tính miễn dịch; làm dễ dàng cho sự truyền đạt tín hiệu thần kinh, co bóp cơ thịt.
Trong cơ thể có rất nhiều loại gốc tự do, mà các gốc nguy hiểm hơn cả là superoxide, ozone, hydrogen peroxide, lipid peroxy nhất là hydroxyl radical, một gốc rất phản ứng và gây ra nhiều tổn thương..
1.2.2. Chất chống oxy hóa
Chất chống oxy hóalà một loại hóa chất giúp ngăn chặn hoặc làm chậm quá trìnhoxi hóachất khác. Sự oxy hóa là loạiphản ứng hóa họctrong đó electronđược chuyển sang chất oxy hóa, có khả năng tạo các gốc tự do sinh ra phản ứng dây chuyền phá hủytế bàosinh vật. Chất chống oxy hóa ngăn quá trình phá hủy này bằng cách khử đi các gốc tự do, kìm hãm sự oxy hóa bằng cách oxy hóa chính
chúng. Để làm vậy người ta hay dùng cácchất khử(nhưthiolhaypolyphenol) làm chất chống oxy hóa[17].
Hình 1.9. Chất chống ôxy hóa
Chất chống ôxy hóa là những chất làm vô hiệu hóa tác động của gốc tự do. Cụ thể hơn, chất ôxy hóa có electron dư thừa để cung cấp cho gốc tự do, nhờ vậy làm vô hiệu hóa tác hại của gốc tự do.
Cơ thể chúng ta có thể tự sản xuất các chất chống ôxy hóa. Tuy nhiên khi tuổi tác càng cao hoặc trong điều kiện môi trường ô nhiễm, thức ăn chứa nhiều độc tố hoặc ăn uống không đủ chất dinh dưỡng, khoáng chất, vitamin v.v làm các gốc tự do xuất hiện quá nhiều nhưng cơ thể lại không sản xuất đủ chất chống ôxi hóa. Do đó cần bổ sung chất chống ôxi hóa từ các sản phẩm hoặc thực phẩm bên ngoài.
Các chất chống oxy hoá có thể bổ sung vào cơ thể như : beta-caroten, chất khoáng selen, các hợp chất flavonoid, polyphenols… Các chất oxy hoá ngoại sinh này thật không xa lạ, chúng có từ các nguồn thiên nhiên là thực phẩm như rau cải, trái cây tươi và một số loại dược thảo.
Ngoài ra trong thực phẩm, các loại phụ gia vừa tạo mùi vị cho sản phẩm còn đóng vai trò là chất chống oxy hóa giúp ngăn chặn hoặc làm chậm quá trình oxy hóa của các chất khác có trong thực phẩm.
1.2.3. Phương pháp phân tích hoạt tính chống ôxy hóa
1.2.3.1. Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa dựa vào khả năng khử gốc tự do DPPH
Khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch chiết rễ mật nhân được phân tích theo
phương pháp của Fu và cộng sự(2002)[11]
Thí nghiệm này autozero bằng nước cất. Mỗi nồng độ lặp lại 3 lần
Hình 1.10. Sơ đồ phản ứng giữa chất chống oxy hóa và gốc tự do DPPH
1.2.3.2. Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa dựa vào tổng năng lực khử
Tổng năng lực khử của chất chống oxy hóa được phân tích dựa vào phương pháp của Oyaizu (1985) [15].
Nguyên tắc:
Năng lực khử của một chất là khả năng chất đó cho điện tử khi tham gia phản ứng oxy hóa khử. Do đó, năng lực khử cũng biểu hiện khả năng chống oxy hóa của một chất. Trong đó, chất khử (chất có hoạt tính oxy hóa) sẽ khử potassium ferricyanid (K3[Fe(CN)6]) thành potassium ferrocyanid (K4[Fe(CN)6]). Ion Fe3+ trong phân tử potassium ferricyanid bị khử thành ion Fe2+ trong phân tử potassium ferrocyanid.
X + K3[Fe(CN)6] K4[Fe(CN)6] Hay X + [Fe(CN)6]3+ [Fe(CN)6]4+
Khi bổ sung Fe3+, Fe3+ sẽ phản ứng với ion ferrocyanid tạo thành một phức hợp ferric ferrocyanid màu xanh dương có công thức (K4[Fe(CN)6]). Phức hợp này có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 700nm.
4Fe3+ + 3 [Fe(CN)6]4+ K4[Fe(CN)6] (màu xanh)
Cường độ màu tỉ lệ thuận với hàm lượng ion ferrocyanid được tạo thành. Do đó cường độ màu càng cao chứng tỏ năng lực khử của mẫu khử càng cao.
1.2.3.3. Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa lipid bằng mô hình Fenton trong hệ Lipid/FeCl2/H2O2
Khả năng chống oxy hóa lipid dựa vào chỉ số TBARS của chất chống oxy hóa được phân tích dựa vào phương pháp của Bao và cộng sự (2010) [1].
Nguyên tắc:
Hệ tác nhân Fenton là một hỗn hợp gồm các ion sắt hóa trị 2 (thông thường dùng muối FeCl2) và hydroperoxit (H2O2), chúng tác dụng với nhau sinh ra gốc tự do •OH, còn Fe2+ bị oxy hóa thành Fe3+ theo phản ứng:
Fe2+ + H2O2 Fe3+ + *OH + OH – (3.3) (k=63l.mol-1s-1)
Phản ứng trên được gọi là phản ứng Fenton do ông là người đầu tiên đã mô tả quá trình này năm 1894. Phản ứng Fenton đã tiếp tục được nghiên cứu bởi nhiều tác giả sau này, các nghiên cứu này cho thấy ngoài phản ứng trên là phản ứng chính thì trong quá trình Fenton còn có xảy ra các phản ứng khác. Tổng hợp lại bao gồm:
Fe2+ + H2O2 Fe3++ *OH + OH – Fe3+ + H2O2 Fe2++ *HO2 + H +
*
*
OH + H2O2 H2O + *HO2 Fe2++ *HO2 Fe3+ + HO2- Fe3++ *HO2 Fe2+ +O2 + H+
Những phản ứng trên chứng tỏ tác dụng của sắt đóng vai trò là chất xúc tác. Theo Walling (1975) gốc tự do •OH sinh ra có khả năng phản ứng với Fe2+ và H2O2 nhưng quan trọng nhất là khả năng phản ứng với nhiều chất hữu cơ (RH) tạo thành các gốc hữu cơ có khả năng phản ứng cao, từ đó sẽ phát triển tiếp tục theo kiểu dây chuỗi:
* OH + Fe2+ OH - + Fe3+ * OH + H2O2 H2O + *HO2 * OH + RH *R + H2O Ứng dụng:
Mô hình Fenton nổi lên trong những năm gần đây như một loại công nghệ cao có tầm quan trọng trong việc đẩy mạnh các quá trình oxy hóa, giúp phân huỷ nhiều loại hợp chất hữu cơ khó phân huỷ như hydrocacbon halogen hóa,
hydrocacbon aromatic, các hoá chất bảo vệ thực vật, dioxin, furan, thuốc nhuộm, các chất hoạt động bề mặt… Hay mô hình này áp dụng chủ yếu trong việc xử lý các vấn đề về môi trường là chủ yếu.
1.2.3.4. Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa dựa vào khả năng khử hydroperoxide
Khả năng khử hydroperoxide của chất chống oxy hóa được phân tích dựa vào phương pháp của Nabavi và cộng sự (2008) [14,17].
Nguyên lý:
Khả năng khử hydroperoxide của BHT có thể là do nó cho điện tử khi tham gia phản ứng oxy hóa. Vì vậy khả năng khử hydroperoxide cũng biểu hiện khả năng chống oxy hóa một chất.
H2O2 xuất hiện trong tự nhiên với hàm lượng thấp, có trong không khí, nước, cơ thể con người, thực vật, vi sinh vật, thực phẩm và nước uống. Nó được sử dụng rộng rãi như một chất tẩy trắng trong ngành công nghiệp dêt, sản xuất giấy. Con người tiếp xúc với H2O2 thông qua môi trường được ước tính là 0.28 mg/kg/ngày. Hydroperoxide thâm nhập vào cơ thể con người thông qua con đường hô hấp, mắt và da. Trong cơ thể, hydroperoxide bị phân hủy tạo ra oxy và nước và điều này có thể tạo ra gốc tự do hydroxyl. Mà gốc này có làm kích hoạt oxy hóa lipid, làm phá hoại cấu trúc ADN. Vì vậy, bản thân H2O2 không độc nhưng có thể gây độc tế bào bởi tạo ra các gốc hydroxyl trong tế bào. Như vậy, loại bỏ H2O2 là rất quan trọng trong suốt hệ thống thực phẩm.
1.2.3.5. Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa lipid bằng mô hình Fenton trong hệ lipid/myoglobin/H2O2
Khả năng chống oxy hóa lipid dựa vào chỉ số TBARS của chất chống oxy hóa được phân tích dựa vào phương pháp của Bao và cộng sự, 2010 [1].
Nguyên lý:
Trong hệ lipid/myoglobin/H2O2, phản ứng oxy hóa lipid bị kích hoạt bởi gốc tự do ferrylmyoglobin (ferrylMb) tạo thành từ phản ứng giữa metmyoglobin (metMb) và H2O2. Sản phẩm oxy hóa lipid tạo thành phản ứng với acid thiobarbituric (TBA) tạo thành màu đỏ hấp thụ cực đại ở bước sóng 535nm. Khi cho chất chống oxy hóa vào hệ phản ứng sẽ ức chế oxy hóa lipid nên cường độ màu đỏ giảm đi. Dựa vào sự thay đổi cường độ màu đỏ để đánh giá hoạt tính chống oxy hóa lipid của chất chống oxy hóa.
1.2.3.6. Phương pháp ORAC
Phương pháp này đo các chất chống oxy hóa ức chế gốc peroxyl, phản ứng của các gốc chống oxy hóa với lipid trong thực phẩm và trong hệ thống sinh lý học. Phương pháp này phát hiện các chất chống oxy hóa phân cực và kém phân cực bằng cách thay đổi dung môi.
Nguyên lý: Phương pháp này đo mức độ phân hủy do bị oxy hóa của fluorescein khi có sự hiện diện của gốc peroxyl. Phản ứng trong điều kiện này được
so sánh với phản ứng trong sự hiện diện của chất chuẩn Trolox (hay vitamin E) và trong hiện diện của mẫu chứa chất chống oxy hóa cần xác định hoạt định. Khi fluorescein bị oxy hóa , cường độ phát huỳnh quang sẽ giảm đi. Tiến hành đo độ giảm cường độ phát quang này liên tục trong 35 phút sau khi thêm chất chống oxy hóa vào. Khi có mặt chất chống oxy hóa, sự phân rã fluorescein sẽ chậm hơn. Xây dựng đường cong biểu diễn sự phụ thuộc độ giảm phát huỳnh quang theo thời gian và vùng dưới đường cong dùng để tính toán. Kết quả tính toán là mmol Trolox/g mẫu.
Ưu điểm của phương pháp này là xác định được có hay không có sự trễ pha trong mẫu chứa các chất chống oxy hóa. Đây là một điều kiện rất thuận lợi khi đo các mẫu thực phẩm chứa cả những hợp chất chống oxy hóa có tốc độ phản ứng khác nhau nhiều
1.2.3.7. Phương pháp TRAP
Phương pháp này thường được sử dụng để đo khả năng chống oxy hóa in
vivo của huyết tương hoặc huyết thanh vì phương pháp này đo các chất chống oxy hóa không phải là enzym như glutathion, acid ascorbic, tocopherol…
Phương pháp TRAP sử dụng gốc peroxyl được tạo thành từ 2,2'-azobis(2- amidinopropane) dihydrochloride(AAPH). Khi cho AAPH vào môi trường plasma, các chất khử sẽ bị oxy hóa. Quá trình oxy hóa này được đo đạt thông qua hàm lượng oxy tiêu thụ bằng một điện cực. Khi có mặt chất chống oxy hóa trong môi trường plasma, quá trình oxy hóa sẽ xảy ra chậm hơn. Giá trị TRAP của mẫu thí nghiệm được tính toán dựa vào độ dài pha lag của mẫu so với độ dài pha lag của mẫu trắng và độ dài pha lag của chất chuẩn là dung dịch Trolox. Kết quả tính toán là mmol Trolox/kg mẫu rắn hoặc mmol Trolox/L mẫu lỏng.
1.2.3.8. Phương pháp FRAP
Phương pháp FRAP được thực hiện đầu tiên bởi Benzie và Strain để đo năng lực khử trong huyết tương nhưng cũng được sử dụng để phân tích các chất chống oxy hóa trong thực vật.
Nguyên tắc xác định hoạt tính chống oxy hóa của phương pháp này dựa trên khả năng của các chất chống oxy hóa trong việc khử phức Fe3+-TPTZ[2,4,6- tripyridyl-s-triazine(TPTZ)] (màu tía) thành phức Fe2+-TPTZ (màu xanh) ở pH thấp. Khi đó, độ tăng cường độ màu xanh tỉ lệ với hàm lượng chất chống oxy hóa có trong nguyên liệu. Mức độ tăng cường màu này được đo ở bước sóng 593nm trong sự so sánh với chất chuẩn là dung dịch FeSO4 hay BHT (butylated hydroxyl toluene). Khi cho phức Fe3+- TPTZ vào môi trường chứa chất chống oxy hóa, các chất chống oxy hóa sẽ nhường điện tử cho phức này và sinh ra Fe2+-TPTZ. Tác động chống oxy hóa được đánh giá bởi sự tăng cường độ màu của phức Fe (II)- TPTZ. Kết quả tính toán là mmol Fe2+/g chất khô. Do đó, khi kết quả tính toán ra lớn thì chúng ta có thể suy đoán rằng trong môi trường phản ứng đó, số lượng các
phân tử có thể nhường điện tử cao. Tuy nhiên, điều này không hoàn toàn đúng vì một phân tử chất chống oxy hóa có thể khử nhiều phức Fe3+-TPTZ cùng lúc. Đây là