3.6.1. Sơ đồ quy trình.
Sau khi tiến hành khảo sát ta được quy trình tối ưu với các thông số cố định: - Ethanol : 80% - Tỉ lệ NL/DM: 1/10
Hình 3.5. Quy trình chiết hoạt chất chống oxy hóa từ rễ mật nhân.
Nghiền nhỏ
Kiểm tra khảnăng chống oxy hóa:
- Khảnăng khử gốc tự do DPPH
- Tổng năng lực khử
Xử lí số liệu lựa chọn nồng độ
dung môi thích hợp cho dịch
chiết có hoạt tính chống oxy hóa
cao nhất.
Rễ mật nhân khô được
bỏ vỏ, cắt lát mỏng Chiết lần 1 - Nồng độ ethanol: 80% - Tỉ lệ NL/DM: 1/10 - Thời gian: 15 phút - Nhiệt độ : 50oC Lọc Bã Dịch chiết lần 1 Chiết lần 2 - Nồng độ ethanol: 80% - Tỉ lệ NL/DM: 1/10 - Thời gian: 15 phút - Nhiệt độ : 50oC Lọc Dịch chiết lần 2 Bã Chiết lần 3 Lọc - Nồng độ ethanol: 80% - Tỉ lệ NL/DM: 1/10 - Thời gian: 15 phút - Nhiệt độ : 50oC Dịch chiết lần 3 Bã
3.6.2 Thuyết minh quy trình.
Nguyên liệu: Rễ mật nhân khô mua ở nơi đảm bảo uy tín, có nguồn gốc rõ ràng. Trên 15 năm tuổi để đảm bảo chất lượng dịch chiết. Bảo quản nơi khô ráo, thoáng mát.
Xử lí: Rễ mật nhân được bỏ vỏ, cắt lát nhỏ để thuận tiện cho công đoạn nghiền phía dưới.
Nghiền nhỏ: Rễ mật nhân khô sau khi được xử lí được nghiền nhỏ bằng máy
nghiền cắt.
Qúa trình nghiền nhỏ nguyên liệu nhằm mục đích phá vỡ màng tế bào, tạo điều kiện cho dung môi dễ thấm ướt vào nguyên liệu, chất tan dễ khuếch tán vào dung môi. Từ đó giúp cho quá trình chiết diễn ra nhanh và triệt để hơn.
Chiết: Mật nhân đã nghiền nhỏ được cho vào các lọ thủy tinh có nắp đậy kín tránh hiện tượng dung môi bay hơi trong quá trình ngâm chiết. Ta tiến hành chiết trong điều kiện: dung môi chiết là Ethanol 80% (tỉ lệ nước/ethanol: 2/8), tỉ lệ nguyên liệu/dung môi: 1/10, thời gian chiết là 15 phút và nhiệt độ chiết là 500C.
Tiến hành chiết siêu âm trong máy siêu âm.
Lọc: Lọc nhằm mục đích loại bỏ các hợp chất không tan ra khỏi hỗn hợp chiết và thu hồi dịch chiết. Tiến hành lọc ở điều kiện phòng và sử dụng giấy lọc Whatman 01.
Sau khi lọc thu được dịch chiết lần 1, ta thu hồi bã và tiến hành chiết lần 2, lần 3 ở các điều kiện chiết tương tự ở lần 1. Sở dĩ ta lựa chọn 3 lần chiết là vì rễ mật nhân nguyên liệu là rễ mật nhân khô ( độ ẩm là 10,196 ± 0,043), hàm lượng ẩm ảnh hưởng đến khả năng hòa tan của nguyên liệu. Cụ thể với hàm lượng ẩm thấp, khả năng hòa tan của NL/DM sẽ thấp, do đó ta thu được dịch chiết không triệt để. Và như đã trình bày ở trên, thời gian kéo dài dịch chiết sẽ lẫn nhiều tạp chất và bay hơi gây hao phí. Hơn nữa, dựa vào kết quả ở hình 3.1, 3.2, 3.3 và 3.4 hoạt tính chống ôxy hóa ở lần 1, lần 2 là cao và lần 3 vẫn còn khá tốt. Do đó, ta lựa chọn chiết 3 lần để tránh hao phí nguyên liệu.
Dịch chiết: Sau khi lọc thu được dịch chiết lần 1, lần 2 và lần 3 từ rễ mật nhân. Ta tiến hành cô quay đuổi dung môi thu hồi dịch chiết nguyên chất, bảo quản lạnh để dùng cho các thí nghiệm sau.
3.7. Phân tích nhận diện các hợp chất có hoạt tính sinh học trong dịch chiết.
Sau khi chiết đem dịch chiết tối ưu đi phân tích nhận diện các hoạt tính sinh học trong dịch chiết. Kết quả nhận diện được trình bày ở bảng 3.2
Bảng 3.2. Các thành phần hợp chất trong rễ mật nhân STT Tên hợp chất sinh học Có (+)/ không(-) Hiện tượng Hình ảnh
1 Phytosterols + Màu nâu đỏ
xuất hiện trong lớp chloroform nhận diện có mặt của phytosterols
2 Triterpenoids + Thấy xuất hiện vòng tròn màu nâu ở chỗ giao nhau giữa 2 lớp, và hình thành màu đỏ đậm chỉ ra sự hiện diện của triterpenoids . 3 Sapoinins - Bọt xuất hiện bền trong 10 phút cho thấy sự hiện diện của saponin.
4 Alkaloids + Kết tủa nâu đỏ tạo thành chứng tỏ hiện diện của alkaloids. 5 Flavonoids + Kết tủa vàng xuất hiện cho thấy có sự hiện diện của flavonoids
6 Tannins - Kết tủa màu
xanh đen xuất hiện chứng tỏ sự
hiện diện của tannin.
7 Glycoside + Xuất hiện vòng tròn màu nâu đỏ ở chỗ giao nhau giữa các lớp chất lỏng chỉ ra sự hiện diện của de- oxysugars 8 Các hợp chất Polyphenol + Kết tủa màu xanh đen xuất hiện chứng tỏ sự hiện diện của Polyphenols
Từ bảng nhận diện các hoạt tính sinh học của rễ mật nhân, trong rễ mật nhân có các hoạt chất phytosterols, triterpenoids, alkaloids, flavonoids, glycoside và các hợp chất polyphenol, không có sapoinins và tannins.
Phytosterol giúp giảm cholesterol, tốt cho tim mạch. Tuy nhiên vòng tròn nâu đỏ không đậm, chứng tỏ hàm lượng không nhiều.
Flavonoid là nhóm hợp chất có nhiều tác dụng sinh học, là chất chống ô xy hóa, do có khả năng dập tắt các gốc tự do như OH, ROO (là các yếu tố gây biến dị, hủy hoại tế bào, ung thư, tăng nhanh sự lão hóa,…). Đồng thời, flavonoid tạo phức với các ion kim loại nên ngăn cản các phản ứng oxy hóa mà những ion đó là enzym xúc tác. Do đó, các chất flavonoid có tác dụng bảo vệ cơ thể, ngăn ngừa xơ vữa
động mạnh, tai biến mạnh, lão hóa, thoái hóa gan, tổn thương do bức xạ. Kết tủa vàng chứng tỏ hàm lượng flavonoid trong rễ mật nhân nhiều.
Triterpenoid là dược chất quan trọng có tác dụng rất lớn trong điều trị bệnh tiểu đường, bệnh xơ gan, viêm gan cấp và ung thư gan. Đây là kết quả dựa trên các công trình nghiên cứu của Viện Hóa dược châu Âu. Người dân một số nước châu Á đã sử dụng triterpenoid có nguồn gốc từ thực vật để chữa trị bệnh ung thư vú theo kinh nghiệm được truyền lại từ đời này sang đời kia. Kết quả khảo cứu cho thấy triterpenoid và chất dẫn xuất của nó là chemoprevention có tính kháng viêm và chống ung thư rất mạnh. Điều này mở ra một tiềm năng và định hướng trong tương lai, liên quan đến triển vọng phòng ngừa và điều trị ung thư vú. Vòng tròn màu nâu đỏ rất đậm chứng tỏ hàm lượng triterpenoid cao.
Alkaloids co hoạt tính sinh học mạnh đên rất mạnh.Công dụng của alkaloids rất đa dạng và phong phú, tùy theo từng loại alkaloids. Trong đó tác dụng chống ung thư: là các hợp chất: taxol, vinblastine, vincristine. Kết tủa nâu đỏ đậm chứng tỏ hàm lượng alkaloids nhiều.
Glycoside có tá dụng tốt cho hệ tim mạch. Tuy nhiên vòng tròn màu nâu đỏ xuất hiện không nhiều do đó hàm lương glycoside trong rễ mật nhân không cao.
Các hợp chất polyphenol có đặc tính chống ôxy hóa, kháng viêm và chống ung thư. Polyphenols cũng giúp động mạch co giãn để duy trì lưu lượng máu và giữ cho động mạch không bị xơ vữa. Hàm lượng polyphenols trong rễ mật nhân là khá cao.
Các hoạt tính sinh học trong rễ mật nhân có chứa hoạt tính chống ôxy hóa cao. Là nguồn dược liệu cần được nghiên cứu, ứng dụng nhiều hơn trong y học để tránh sử dụng bừa bãi và sử dụng triệt để nguồn nguyên liệu quý hiếm từ tự nhiên này.
3.7.1. Định lượng Polyphenols trong dịch chiết rễ mật nhân Chuẩn bị 2 ống nghiệm: - 1 ống nước cất để làm mẫu trắng. - 1 ống mẫu gồm: + 0,1 ml dịch chiết + 0,9 ml nước cất + 1ml thuốc thử Folin 10% + 2,5 ml Na2CO3 7,5%
Lắc đều ủ trong bóng tối 30 phút.
Hỗn hợp được đo ở bước sóng 760 nm bằng máy UV- Vis.
OD đo được ở bước sóng λ = 760nm Hàm lượng Polyphenols
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN
Qua kết quả nghiên cứu tách chiết và xác định hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết từ rễ mật nhân thu được những kết quả sau:
1. Rễ mật nhân khô là nguồn chứa chất chống oxy hóa tự nhiên rất cần thiết cho chúng ta.
2. Điều kiện thích hợp để chiết chất chống oxy hóa cao nhất từ rễ mật nhân khô quy mô nhỏ bằng phương pháp ngâm chiết là:
- Dung môi chiết: Ethanol. - Nồng độ Ethanol: 80%
- Tỉ lệ nguyên liệu/dung môi: 1/10 - Thời gian: 15 phút.
- Nhiệt độ: 500C. - Số lần chiết: 3 lần.
KIẾN NGHỊ
Mặc dù đã cố gắng trong quá trính làm đề tài, song do thời gian và điều kiện nghiên cứu còn gặp nhiều khó khăn nên đề tài còn nhiều hạn chế và thiếu sót. Do vậy em xin đề xuất một số ý kiến sau:
- Mật nhân là nguồn cung cấp chất chống oxy hóa dồi dào từ tự nhiên, tuy nhiên ở nước ta vẫn chưa có nhiều bài viết cũng như các công trình nghiên cứu để tận dụng nguồn nguyên liệu quý giá từ tự nhiên này. - Nghiên cứu quy trình chiết chống oxy hóa từ các bộ phận khác của
mật nhân: vỏ, thân, lá,..
- Tiếp tục nghiên cứu quy trình đặc biệt trong công đoạn chiết (thực hiện chiết trong môi trường có PH khác nhau, các loại dung môi khác,..) - Cần nghiên cứu khả năng ứng dụng rộng rãi của chế phẩm vào trong
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng việt
1) Huỳnh Nguyễn Duy Bảo(2003), Xây dựng phương pháp đánh giá hoạt tính
chống oxy hóa dựa vào phản ứng Fenton trong hệ lipid/myoglobin/H2O2, Báo cáo đề tài nghiên cứu khoa học cấp Trường, Trường Đại học Nha Trang.
2) Vũ Văn Đô (1998), Cơ sở lý thuyết các quá trính hóa học, nhà xuất bản Giáo Dục. 3) Lê Thị Hương Hà (2012), Nghiên cứu tách chiết và khảo sát hoạt tính kháng khuẩn – chống ôxy hóa của cao dịch chiết từ củ hành tăm, Luận văn thạc sĩ, Đại
học Nha Trang.
4) Phan Thị Kim Ngân (2012), Nghiên cứu tách chiết và khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết từ tim sen, Đồ án tốt nghiệp, Đại học Nha Trang.
5) Lê Ngọc Thụy, Các quá trình công nghệ cơ bản trong sản xuất thực phẩm, nhà xuất bản Bách Khoa Hà Nội.
6) Nguyễn Đắc Vinh (2009), Nghiên cứu tách chiết và xác định hợp tính chống ôxy hóa của các polyphenol từ vỏ khoai tây và khoai lang, ứng dụng trong bảo quản thực phẩm, Đề tài nghiên cứu khoa học, Đại học Khoa học tự nhiên.
7) Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7038 – 2002 8) Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 3700 - 79
Tiếng Anh
9) Caltagirone, S., Rossi, C. and Poggi, A.(2000), “Flavonoids apigenin and quercetin inhibit melanoma growth and metastatic potential”, Intern. J. Cancer 87, pp. 595-600
10) C.P. Varghese, C.Ambrose, S.C.Jin, Y.J.Lim and T.Keisaban(2012), Antioxidant and Anti-inflammatory Activity of Eurycoma Longifolia Jack, A Traditional Medicinal Plant in Maylaysia.
11) Fu, H., Shieh, D., Ho, C. (2002), Antioxydant and free radical scavenging activitives of edible mushroom. J. Foof Lipids 9, 35-46.
12) Harborne Ạ.(1998). phytochemical methods A.Guide to Modern techigues of plant Analysis .3rd ed. Springer.
13) Hermann, K. (1976), “Flavonols and flavones in food plants”, J.Food Tech 01, IZ, 433-448.
14) Irina Pavlovna Ivanov, Svetlana Vladimirovna Trofimova, Igor Mihailovich Piskarev,Natalia Alekseevna Aristova, Olga Evgenevna Burhina, (16 December 2011), Mechanism of chemiluminescence in Fenton reactionVol.3, No.1, 88-100 (2012).
15) Oyaizu, M. (1986). Antioxidative activity of browning products of glucosamine fractionated by organic solvent and thin-layer chroma-tography. Nippon Shokuhin Kogyo Gakkaishi, 35: 771-775
16) Purwantiningsih, Abas Hj Hussin, Kit Lam Chan, 2011, Free radical scavenging activity of the standardized ethanolic extract of eurycoma longifolia(taf-273).
17) Pisoschi AM, Negulescu GP (2011), Methods for Total Antioxidant Activity Determination: A Review. Biochem & Anal Biochem 1:106.
18) Werner Dabelstein, Arno Reglitzky, Andrea Schütze and Klaus Reders,(2007)"Automotive Fuels" in Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry ‘ Wiley-VCH. Website 19) http://123doc.vn/document/945941-nghien-cuu-chiet-xuat-quassinoid-cay-ba- benh.htm?page=6 20) http://www.eurycomalongifolia.com/ 21) http://www.phununet.com/WikiPhununet/ChiTietWiKi.aspx?m=0&StoreID=13031 22) http://vi.wikipedia.org/wiki/B%C3%A1_b%E1%BB%87nh 23) https://www.youtube.com/watch?v=cMqaAX9malQ 24)http://zennova.vn/chong-oxy-hoa/goc-tu-do-va-chat-chong-oxy-hoa-22.aspx
PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1
CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 1.1.CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HÓA HỌC 1.1.1. Phương pháp xác định hàm lượng ẩm
Phương pháp xác định hàm lượng ẩm của nguyên liệu bằng phương pháp sấy.
Nguyên lý: Dùng nhiệt độ cao để làm bay hơi hết nước trong mẫu thử, sau
đó dựa vào hiệu số khối lượng của mẫu thử trước và sau khi sấy sẽ tính được hàm lượng nước trong thực phẩm.
Dụng cụ, hóa chất:
Tủ sấy điều chỉnh được nhiệt độ. Cân phân tích, độ chính 10-4 g. Cốc sấy, đũa thủy tinh.
Bình hút ẩm có chứa Silicagen.
Tiến hành:
Sấy cốc đến khối lượng không đổi: Cốc được rửa sạch, úp khô, sấy ở nhiệt độ 100 – 105oC trong khoảng 1 giờ, lấy ra làm nguội trong bình hút ẩm rồi đem cân. Sấy đến khối lượng không đổi (Sấy đến khi nào giữa 2 lần cân liên tiếp, sai khác không quá 5.10-4g).
Cân chính xác 1 lượng mẫu đã được chuẩn bị trước(1g mẫu) cho vào cốc đã sấy khô đến khối lượng không đổi. Chuyển cốc sấy vào tủ sấy. Sấy ở 60 – 80oC trong 2 giờ. Sau đó, nâng nhiệt lên 100 – 105oC, sấy liên tục trong 3 giờ. Cứ sau 1 giờ đảo mẫu 1 lần.
Lấy mẫu ra để nguội trong bình hút ẩm, rồi đem cân trên cân phân tích, sau đó sấy tiếp ở nhiệt độ 100 – 105oC đến khối lượng không đổi.
Tính kết quả:
1 2 100% 1 G G X G G Trong đó:
XH2O: Độ ẩm (hàm lượng nước) của thực phẩm (%). G1: Khối lượng cốc sấy và mẫu thử trước khi sấy (g).. G2: Khối lượng cốc sấy và mẫu thử sau khi sấy (g). G: Khối lượng cốc sấy (g).
Chuẩn bị 5g rễ mật nhân khô được nghiền nhỏ, sấy ở 1050C đến khối lượng không đổi. Kết quả của 3 lần lặp lại được thể hiện ở bảng 3.1.
Bảng PL 2. Hàm lượng ẩm của rễ mật nhân
Mẫu Khối lượng cốc sấy (g) Khối lượng cốc và mẫu ban đầu (g) Khối lượng cốc sấy và mẫu sau
khi sấy(g) Hàm lượng ẩm (%) Chất khô (%) 1 47,0171 52,0171 51,5053 10,235 89,765 2 50,1712 55,1712 54,6638 10,149 89,851 3 54,1941 59,1941 58,6840 10,203 89,797 Hàm lượng trung bình 10,196 ± 0,043 89,804± 0,043
1.1.2. Xác định hàm lượng tro khoáng của nguyên liệu bằng phương pháp nung Nguyên lý: dùng nhiệt độ 550 – 600oC để đốt cháy hoàn toàn các hợp chất hữu cơ. Phần còn lại đem cân và tính ra hàm lượng tro toàn phần trong thực phẩm.
Dụng cụ và hóa chất:
Chén nung bằng sứ. Bếp điện.
Tủ nung điều chỉnh được nhiệt độ đến 550 – 600oC. Cân phân tích.
Bình hút ẩm có chứa silicagen. H2O2 10 thể tích.
Tiến hành:
Cốc nung rửa sạch cho vào nung ở nhiệt độ to= 550oC đến khối lượng không đổi. Để nguội ở bình hút ẩm và cân phân tích chính xác đến 10-4g.
Cho vào chén nung khoảng 3g mẫu (đã chuẩn bị trước). Cân tất cả trên cân phân tích, với độ chính xác như trên. Trước khi nung thành tro trắng thì ta tiến hành hóa thành tro đen trên bếp điện trước.
Cho tất cả vào lò nung và tăng nhiệt độ từ từ cho đến 550 – 600oC, nung cho đến khi thành tro trắng rồi đem ra làm nguội trong bình hút ẩm và tiến hành cân trên cân phân tích. Cứ làm như vậy đến khi cân thấy khối lượng không đổi. Trường hợp còn tro đen, lấy ra để nguội cho thêm vài giọt H2O2 10 thể tích và nung lại thành tro trắng. Để nguội trong bình hút ẩm và cân ở cân có độ chính xác như trên. Tiếp tục nung thêm ở nhiệt độ trên trong 30 phút rồi để nguội trong bình hút ẩm và cân, lặp đi lặp lại thao tác này cho tới trọng lượng không đổi. Kết quả giữa 2 lần nung và cân liên tiếp không được cách nhau quá 5.10-4g.
Tính kết quả: 2 *100% 1 G G X G G Trong đó:
G: Khối lượng cốc nung (g)