Xác định các mức yếu tố làm th a mãn đồng thời các thông số k thuật mong muốn.
Kết hợp tối ƣu hoá cho các yếu tố để cho ra kết quả mong muốn đạt đƣợc và mô tả kết quả tối ƣu đó.
Cho ra một kết quả đặc trƣng khi nó bị ảnh hƣởng bởi những sự thay đổi của các mức yếu tố vƣợt quá mức đang quan tâm.
Đạt đƣợc một sự hiểu biết về định lƣợng của hệ thống xử lí vƣợt qua vùng thử nghiệm.
Sản xuất các sản phẩm đặc trƣng trong vùng, ngay cả khi kết hợp với các yếu tố không chạy.
1.7.3. u, như c điểm của RSM [11] u điểm:
Mang tính thực tế vì số liệu đƣợc lấy từ thực nghiệm.
Có thể áp dụng cho bất kì hệ thống nào có biến đầu vào và mục tiêu đầu ra. Đánh giá đƣợc tác động của các yếu tố ảnh hƣởng.
Thực hiện dễ dàng, nhanh chóng.
hư c điểm:
Chỉ mang tính gần đúng.
Phạm vi tác dụng bị giới hạn, mặt đáp ứng sẽ không có giá trị đối với những vùng khác ngoài dải yếu tố đang nghiên cứu.
C ƣơn II NGU ÊN VẬT LIỆU VÀ P ƢƠNG P ÁP NGHIÊN CỨU NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu
Lá Trầu Không (Piper betle Linn) đƣợc thu hái trực tiếp tại vƣờn trồng trầu của ngƣời dân ở Thành phố Nha Trang, Khánh Hòa trong tháng 4/2014. Chỉ những lá đạt mức độ trƣởng thành mới đƣợc tuyển chọn. Nguyên liệu sau khi thu hái, đƣợc vận chuyển nhanh chóng về phòng thí nghiệm để tiến hành làm khô b ng không khí nóng ở nhiệt độ 50oC sử dụng tủ sấy có kiểm soát nhiệt độ (Dicell, XR60C, Belluno, Italy) đến khi đạt đƣợc độ ẩm khoảng 10%, sau đó nguyên liệu đƣợc nghiền thành kích thƣớc nh và đƣợc sàng qua lỗ có kích thƣớc (2 mm), gân lá và những phần lá có kích thƣớc lớn hơn lỗ sàng bị loại b . Nguyên liệu khô đƣợc bao gói trong túi nhựa, hút chân không và đƣợc bảo quản đông ở nhiệt độ - 66oC cho đến khi sử dụng.
2.2. Hóa chất
Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu đều đạt hạng phân tích. Folin- Ciocalteu’s, Na2CO3, AlCl3, NaOH, NaNO2, K3(Fe[CN]6), a xít trichloracetic (TCA), NaH2PO4, Na2HPO4, Ethanol mua của hãng Merck (Đức). 1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl (DPPH), a xít gallic, quecertin mua từ Sigma Aldride (Mỹ).
2.3. Thi t k thí nghiệm tố ƣu t eo p ƣơn p áp bề mặt đáp ứng
Sau khi khảo sát ảnh hƣởng của bốn thông số quan trọng ảnh hƣởng đến điều kiện chiết polyphenol từ lá Trầu Không bao gồm: Nhiệt độ, thời gian, tỉ lệ dung môi/nguyên liệu và nồng độ ethanol. Tuy nhiên, những nghiên cứu trên chỉ khảo sát ảnh hƣởng của từng yếu tố riêng rẽ (thí nghiệm yếu tố từng phần) mà không khảo sát đƣợc ảnh hƣởng đồng thời của các yếu tố. Vì vậy, bố trí thí nghiệm nh m đánh giá ảnh hƣởng tổng hợp (thí nghiệm yếu tố toàn phần) là cần thiết để thiết lập đƣợc điều kiện chiết tối ƣu cho hàm lƣợng polyphenol cao nhất. Để đạt đƣợc mục tiêu này, phƣơng pháp bề mặt đáp ứng (Response surface methodology) đƣợc lựa chọn để tối ƣu hóa điều kiện chiết polyphenol từ lá Trầu Không.
Mục tiêu của nghiên cứu này là nh m ác định đƣợc điều kiện chiết tối ƣu lá Trầu Không để thu đƣợc dịch chiết có hàm lƣợng polyphenol cao nhất. Theo đó, các biến độc lập bao gồm:Thời gian chiết (X1), Nhiệt độ chiết (X2), tỉ lệ dung môi/nguyên liệu chiết (X3) và nồng độ ethanol (X4). Biến phụ thuộc (hàm mục tiêu) là hàm lƣợng polyphenol (Y).
Miền khảo sát tối ƣu của các biến độc lập đƣợc ác định dựa vào kết quả nghiên cứu của Lê Thị Nhã Uyên (2014). Số thí nghiệm cần tiến hành là 27 thí nghiệm (Bảng 2.1), trong đó: 16 (24) thí nghiệm ở hai mức (trên và dƣới), 8 (2 × 4) thí nghiệm ở điểm sao và 3 thí nghiệm ở tâm. Mô hình toán học mô tả ảnh hƣởng của các biến độc lập đối với biến phụ thuộc có dạng hàm đa thức bậc hai nhƣ sau:
4 1 4 1 2 4 1 , 0 j j j jj j i j i ij j j k B B X B X X B X Y Trong đó: Yk: Biến phụ thuộc
Xi,j: Nhân tố mã hóa của biến độc lập ảnh hƣởng đến Yk B0: Hệ số hồi qui bậc 0
Bj: Hệ số hồi qui bậc 1 mô tả ảnh hƣởng của biến Xj đến Yk Bij: Hệ số ảnh hƣởng đồng thời của biến Xi và Xj đến Yk
Bjj: Hệ số hồi qui bậc hai mô tả ảnh hƣởng của biến X2j đến Yk
Bảng 2.1 và Bảng 2.2 trình bày ma trận thí nghiệm tối ƣu hóa quá trình chiết theo phƣơng pháp bề mặt đáp ứng (response surface methodology), bố trí theo kiểu trực tâm quay (CCD) hoàn toàn ngẫu nhiên với sự hỗ trợ của phầm mềm DX, với giá trị = 2. Số liệu thực nghiệm đƣợc xử lý b ng phần mềm Stagraphic để xác định các thông số tối ƣu.
Bảng 2.1. Ma trận bố trí thí nghiệm mã hóa các bi n độc lập
Tên bi n Mức nghiên cứu
Bi n thực Bi n
mã - - 1 0 + 1 +
X1: Nhiệt độ chiết (oC) U1 20 30 40 50 60 X2: Thời gian chiết (phút) U2 40 50 60 70 80 X3: Tỉ lệ nguyên liệu/dung môi (g/ml) U3 30 40 50 60 70 X4: Nồng độ ethanol (%) U4 20 40 60 80 100
= 2, Umin, Umax là giá trị cận trên (+1) và cận dƣới (-1) của biến độc lập, U0 = (Umin + Umax)/2 là giá trị trung bình của cận trên và cận dƣới.
Bảng 2.2. Ma trận bố trí các thí nghiệm đầ đ Stt Bi n thực Bi n mã hóa Hàm mục tiêu X1 X2 X3 X4 U1 U2 U3 U4 Y 1 50 30 40 40 -1 -1 -1 -1 - 2 50 30 40 80 -1 -1 -1 +1 - 3 50 30 60 40 -1 -1 +1 -1 - 4 50 30 60 80 -1 -1 +1 +1 - 5 70 30 40 40 +1 -1 -1 -1 - 6 70 30 40 80 +1 -1 -1 +1 - 7 70 30 60 40 +1 -1 +1 -1 - 8 70 30 60 80 +1 -1 +1 +1 - 9 50 50 40 40 -1 +1 -1 -1 - 10 50 50 40 80 -1 +1 -1 +1 - 11 50 50 60 40 -1 +1 +1 -1 - 12 50 50 60 80 -1 +1 +1 +1 - 13 70 50 40 40 +1 +1 -1 -1 - 14 70 50 40 80 +1 +1 -1 +1 - 15 70 50 60 40 +1 +1 +1 -1 - 16 70 50 60 80 +1 +1 +1 +1 - 17 60 20 50 60 0 - 0 0 - 18 60 60 50 60 0 + 0 0 - 19 40 40 50 60 - 0 0 0 - 20 80 40 50 60 + 0 0 0 - 21 60 40 30 60 0 0 - 0 - 22 60 40 70 60 0 0 + 0 - 23 60 40 50 20 0 0 0 - - 24 60 40 50 100 0 0 0 + - 25c 60 40 50 60 0 0 0 0 - 26c 60 40 50 60 0 0 0 0 - 27c 60 40 50 60 0 0 0 0 -
(*) thí nghiệm đƣợc tiến hành tại điểm sao, (c) thí nghiệm đƣợc tiến hành tại điểm tâm.
2.4. Chuẩn bị dịch chi t
Trong tất cả các thực nghiệm việc chuẩn bị dịch chiết đƣợc thực hiện nhƣ sau (Hình 2.1): Nguyên liệu lá trầu đƣợc nghiền nh đến kích thƣớc nhất định (2 mm), đƣợc trộn với dung môi chiết theo tỉ lệ thích hợp. Quá trình chiết đƣợc thực hiện theo phƣơng pháp ngâm truyền thống, sử dụng bể ổn nhiệt có điều khiển nhiệt độ (S300, ELMA, Germany). Sau quá trình chiết, dịch chiết đƣợc ly tâm ở tốc độ 5000 vòng/phút sử dụng máy ly tâm (HERMLE Z323, Hermle, Germany) để thu đƣợc dịch chiết trong (dịch chiết thô), dịch chiết này đƣợc bảo quản lạnh cho đến khi phân tích hoặc tiến hành phân tích ngay.
Hình 2.1 ơ đồ quá trình chi t để thu dịch chi t
2 5 Các p ƣơn p áp p n tíc
2 5 1 Xác định hàm ẩm
Hàm lƣợng ẩm đƣợc ác định theo phƣơng pháp của AOAC (1990). Tóm tắt: Khoảng 3 g mẫu đƣợc sấy ở 105oC đến khối lƣợng không đổi, sau đó cân để xác định hàm ẩm trong nguyên liệu theo công thức sau:
Xử lý Chiết Ly tâm Dịch chiết Phân tích các chỉ tiêu Nguyên liệu
100 (%) 1 2 1 m m m W Trong đó: W: hàm lƣợng ẩm (%)
m1: là khối lƣợng mẫu ban đầu, trƣớc khi sấy (g)
m2: là khối lƣợng mẫu sau khi ấy đến khối lƣợng không đổi (g)
2.5.2 Xác định hiệu suất chiết
Hiệu suất chiết đƣợc ác định b ng phƣơng pháp cân khối lƣợng. Sau khi thu đƣợc dịch chiết, để ác định hiệu suất chiết, dịch chiết đƣợc bay hơi ở điều kiện áp suất thấp sử dụng thiết bị cô quay chân không (V 850, Buchi, Thụy s ) đến khi dung môi chiết đƣợc loại b hoàn toàn, lƣợng chất hòa tan khô thu đƣợc đem cân ác định khối lƣợng và tính toán hiệu suất chiết theo công thức sau:
Trong đó:
HS: Hiệu suất chiết, đơn vị %
m1: Khối lƣợng mẫu đem chiết, đơn vị là g
m2: Khối lƣợng chất khô thu đƣợc sau khi bay hơi hết dung môi chiết, đơn vị là g
2 5 3 Xác định h m ư ng polyphenol tổng
Hàm lƣợng polyphenol tổng đƣợc ác định theo phƣơng pháp của Singleton và cộng sự (1999) với một vài thay đổi nh . Tóm tắt: Chính xác 0,1 ml dịch chiết đã đƣợc pha loãng tới nồng độ thích hợp đƣợc trộn với 0,9 ml nƣớc cất, sau đó thêm 1 ml thuốc thử Folin – Ciocalteu’s 0,2 N và cuối cùng thêm 2,5 ml Na2CO3 7,5%. Hỗn hợp đƣợc giữ ở nhiệt độ phòng trong tối, sau đúng 30 phút, độ hấp thu quang học của hỗn hợp phản ứng đƣợc đo trên máy quang phổ kế ở bƣớc sóng 760 nm (Specphotometer, Cary 50, Varian, Australia). Hàm lƣợng polyphenol tổng đƣợc tính toán từ đƣờng chuẩn a xít Gallic. Kết quả báo cáo cuối cùng là mg a xít Gallic tƣơng đƣơng (GAE)/g chất khô.
2 5 4 Xác định h m ư ng flavonoid tổng
Hàm lƣợng polyphenol tổng đƣợc ác định theo phƣơng pháp của Lillian Barros và cộng sự (2007) với một vài hiệu chỉnh nh . Cụ thể: Chính xác 0,25 ml dịch chiết đã pha loãng đến nồng độ thích hợp đƣợc trộn với nƣớc cất để đạt thể tích cuối cùng 1,5 ml, sau đó thêm 0,075 ml NaNO2 5%, giữ hỗn hợp phản ứng ở nhiệt độ phòng trong 10 phút trƣớc khi thêm 0,15 AlCl3 10% và tiếp tục giữ thêm 10 phút ở cùng điền kiện nhƣ trên, sau đó thêm 0,5 ml NaOH 1M và cuối cùng thêm 0,275 ml nƣớc cất. Hỗn hợp phản ứng đƣợc đo độ hấp thu quan học ở bƣớc sóng ở 510 nm (Specphotometer, Cary 50, Varian, Australia). Hàm lƣợng flavonoid tổng đƣợc tính toán từ đƣờng chuẩn sử dụng Quercitin. Kết quả cuối cùng đƣợc báo cáo là mg Quercitin tƣơng đƣơng (QE)/g chất khô.
2 5 5 Xác định hoạt tính khử gốc tự do DPPH
Khả năng thu gốc tự do DPPH đƣợc ác định theo phƣơng pháp của Fu và cộng sự (2002) với một vài hiệu chỉnh nh . Tóm tắt nhƣ sau: Khoảng 20 µl đến 140 µl dịch chiết trộn với nƣớc cất để đạt thể tích tổng cộng 3 ml, sau đó thêm 1 ml dung dịch DPPH 0,1 mM, lắc đều và để yên trong bóng tối 30 phút. Độ hấp thu quang học đƣợc đo ở bƣớc sóng 517 nm (Spectrophotometer, Carry 50, Varian, Australia). Khả nămg khử gốc tự do DPPH đƣợc ác định theo công thức sau: DPPH (%) = 100 × (ACT – ASP)/ACT. Trong đó: ACT: Độ hấp thu quang học của mẫu trắng không chứa dịch chiết; ASP: Độ hấp thu quang học của mẫu có chứa dịch chiết. Kết quả báo cáo bởi giá trị IC50 là thể tích của dịch chiết khử đƣợc 50% gốc tự do DPPH ở điều kiện ác định. Giá trị IC50 càng thấp thì hoạt tính khử gốc tự do DPPH càng cao. Vì vậy, hoạt tính chống oxi hóa càng mạnh.
2 5 6 Xác định tổng năng ực khử
Năng lực khử đƣợc ác định theo phƣơng pháp của Oyaizu (1986) với một vài hiệu chỉnh nh . Cụ thể: Nhiều thể tích khác nhau của dịch chiết đƣợc trộn với đệm phosphate có pH = 6,6 để đạt thể tích cuối cùng 1,5 ml trƣớc khi thêm 0,5 ml K3(Fe[CN]6) 1%. Hỗn hợp đƣợc ủ ở 50oC trong 20 phút, làm nguội b ng vòi nƣớc
chảy trong 5 phút, sau đó thêm 0,5 ml TCA 10% và tiếp đến là 2 ml nƣớc cất, cuối cùng 0,4 ml AlCl3 0,1% đƣợc thêm vào. Độ hấp thu quang học đƣợc ác định tại bƣớc sóng 700 nm (Spectrophotometer, Carry 50, Varian, Australia). Độ hấp thu quang học càng cao thì năng lực khử càng mạnh. Kết quả đƣợc tính toán với giá trị IC50, là lƣợng mẫu làm tăng độ hấp thu quang học lên 0,5.
2 6 P ƣơn p áp ử lý số liệu
Các phân tích đƣợc tiến hành lặp lại để đảm bảo thực hiện phân tích ANOVA. Số liệu đƣợc phân tích trên phần mềm SPSS 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Kiểm định Tukey đƣợc thực hiện sau phân tích ANOVA để đánh giá sự khác nhau của các giá trị với mức ý ngh a p < 0,05. Các hình vẽ và đồ thị đƣợc vẽ trên phần mềm Exell (Office 2003, Microsoft, USA).
C ƣơn III ẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. K t quả tố óa đ ều kiện chi t polyphenol từ lá Trầu
Bảng 3.1. K t quả bố trí thí nghiệm đầ đ theo qui hoạch trực tâm quay
Stt Bi n thực Bi n mã hóa Hàm mục tiêu X1 X2 X3 X4 U1 U2 U3 U4 Y 1 30 50 40 40 - 1 - 1 - 1 - 1 166,23 2 30 50 40 80 - 1 - 1 - 1 + 1 146,16 3 30 50 60 40 - 1 - 1 + 1 - 1 170,71 4 30 50 60 80 - 1 - 1 + 1 + 1 149,13 5 30 70 40 40 - 1 + 1 - 1 - 1 178,88 6 30 70 40 80 - 1 + 1 - 1 + 1 162,95 7 30 70 60 40 - 1 + 1 + 1 - 1 190,05 8 30 70 60 80 - 1 + 1 + 1 + 1 180,45 9 50 50 40 40 + 1 - 1 - 1 - 1 191,90 10 50 50 40 80 + 1 - 1 - 1 + 1 163,42 11 50 50 60 40 + 1 - 1 + 1 - 1 175,82 12 50 50 60 80 + 1 - 1 + 1 + 1 167,47 13 50 70 40 40 + 1 + 1 - 1 - 1 179,30 14 50 70 40 80 + 1 + 1 - 1 + 1 175,60 15 50 70 60 40 + 1 + 1 + 1 - 1 195,67 16 50 70 60 80 + 1 + 1 + 1 + 1 174,94 17 20 60 50 60 - 0 0 0 170,78 18 60 60 50 60 + 0 0 0 184,66 19 40 40 50 60 0 - 0 0 174,18 20 40 80 50 60 0 + 0 0 171,03 21 40 60 30 60 0 0 - 0 169,73 22 40 60 70 60 0 0 + 0 192,42 23 40 60 50 20 0 0 0 - 187,51 24 40 60 50 100 0 0 0 + 146,55 25 40 60 50 60 0 0 0 0 180,25 26 40 60 50 60 0 0 0 0 178,17 27 40 60 50 60 0 0 0 0 181,47
Kết quả bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hƣởng các yếu tố thời gian chiết (X1), nhiệt độ chiết (X2), tỉ lệ dung môi/nguyên liệu chiết (X3) và nồng độ ethanol (X4) đến quá trình chiết polyphenol từ lá Trầu. Số liệu thực nghiệm đƣợc xử lý b ng phần mềm Stagraphic để thu đƣợc kết quả tối ƣu trong Bảng 3.1.
Đây là bố trí thí nghiệm tối ƣu với bốn yếu tố tố thời gian chiết (X1), nhiệt độ chiết (X2), tỉ lệ nguyên liệu/dung môi chiết (X3) và nồng độ ethanol (X4) với hàm mục tiêu, thiết kế này gồm 27 thí nghiệm, bố trí theo kiểu trực tâm quay để tìm điều kiện tối ƣu.
3.2. Ảnh ƣởng c a các y u tố chi t đ n hàm mục tiêu
Cột nào n m có đỉnh n m bên phải đƣờng thẳng thì có ảnh hƣởng đáng kể đến hàm mục tiêu. Trong trƣờng hợp này X1, X2, X3, X4, X4X4 có ảnh hƣởng đáng kể. Vì các nhân tố riêng rẽ có ảnh hƣởng đáng kể nên sự tƣơng tƣơng của chúng của cũng ý ngh a đến hàm mục tiêu.
Phƣơng trình hồi qui cho thấy hàm lƣợng polyphenol chịu ảnh hƣởng bậc 1, bậc 2 của thời gian (X1), nhiệt độ chiết (X2), tỉ lệ dung môi/nguyên liệu chiết (X3), nồng độ ethanol (X4) và chịu ảnh hƣởng đồng thời của các cặp nhân tố.
Mức độ ảnh hƣởng của các nhân tố bậc 1 và bậc 2 đối với hàm lƣợng polyphenol đƣợc xếp theo thứ tự nhƣ sau: nồng độ ethanol, thời gian chiết, nhiệt độ chiết, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu. Nhƣ vậy, nồng độ ethanol có ảnh hƣởng lớn nhất đối với hàm lƣợng polyphenol đối với cả bậc 1 và bậc 2. Thời gian (X1), nhiệt độ chiết (X2), tỉ lệ dung môi/nguyên liệu chiết (X3), nồng độ ethanol (X4) và X4X4 ảnh hƣởng đến kể đến hàm lƣợng polyphenol. Các cặp nhân tố thời gian và nồng độ ethanol (X1X2), nhiệt độ và tỉ lệ dung môi/nguyên liệu (X2X3), nhiệt độ và nồng độ ethanol (X2X4), thời gian chiết và tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (X1X3), tỉ lệ dung môi/nguyên liệu và nồng độ ethanol (X3X4), thời gian chiết và nồng độ ethanol