Còn gọi là phƣơng pháp chiết uất nhiều bậc, phƣơng pháp chiết nhiều dòng tƣơng đối hay phƣơng pháp chiết ngƣợc dòng gián đoạn.
n .3. ệ t ốn t t bị c t uất bán l n tục
Phƣơng pháp này có sử dụng một hệ thống thiết bị gồm nhiều bình chiết khác nhau, có thể mắc thành một dãy gồm 4-16 bình chiết nối tiếp nhau.Ở đây, quá trình coi nhƣ ngƣợc chiều tƣơng đối vì thực tế nguyên liệu không chuyển động.
iến h nh
Lúc đầu, nguyên liệu và dung môi đƣợc nạp trong tất cả các thiết bị, nguyên liệu đƣợc ngâm vào dung môi trong một khoảng thời gian ác định (tùy thuộc vào nguyên liệu và dung môi). Lúc này nguyên liệu và dung môi đều không chuyển động. Sau đó dịch chiết đƣợc chuyển tuần tự từ thiết bị này sang thiết bị khác. Hệ thống tổ hợp kín các bình chiết này cho phép đóng ngắt một cách có chu k một trong những thiết bị ra kh i hệ thống tuần hoàn, cho phép tháo bã nguyên liệu ở bình đã đƣợc chiết kiệt rồi nạp nguyên liệu mới. Sau đó thiết bị này lại đƣợc đƣa vào hệ thống tuần hoàn và dịch chiết đậm đặc nhất đƣợc dẫn qua nó mà dịch chiết này vừa đi qua tất cả các thiết bị còn lại. Tiếp theo, lại đóng ngắt một thiết bị kế tiếp mà trƣớc đó dung môi mới vừa đƣợc dẫn qua. Số thiết bị các nhiều thì quá trình ảy ra càng gần với quá trình liên tục. Ở đây, bã nguyên liệu trƣớc khi ra kh i hệ thống thiết bị sẽ đƣợc tiếp úc với dung môi mới nên nguyên liệu sẽ đƣợc chiết kiệt. Dịch chiết trƣớc khi ra kh i
hệ thống sẽ đƣợc tiếp úc với nguyên liệu mới nên nên dịch chiết thu đƣợc sẽ đậm đặc nhất. Nhƣ vậy có thể nói quá trình ảy ra theo nguyên tắc “dung môi mới tiếp úc với nguyên liệu cũ và dƣợc liệu mới tiếp úc môi cũ”. Trong phƣơng pháp này, quá trình ảy ra gần với quá trình ngƣợc chiều, do đó phƣơng pháp này còn đƣợc gọi là phƣơn pháp chiết ngƣợc chiều tƣơng đối.
u điểm (so với phƣơng pháp chiết gián đoạn)
Dịch chiết đậm đặc.
Nguyên liệu đƣợc chiết kiệt.
hư c điểm
Hệ thống thiết bị cồng kềnh, chiếm nhiều diện tích lắp đặt. Vận hành phức tạp.
Thao tác thủ công.
hông tự động hóa quá trình đƣợc. 1.6.2.3. Phƣơng pháp chiết uất liên tục
iến h nh
Phƣơng pháp này đƣợc thực hiện trong những thiết bị vận hành liên tục. Ở đây, nguyên liệu và dung môi liên tục đƣợc đƣa vào và chuyển động ngƣợc chiều nhau trong thiết bị. Nguyên liệu di chuyển đƣợc trong thiết bị là nhờ cơ cấu vận chuyển chuyên dùng khác nhau. Dịch chiết trƣớc khi ra kh i thiết bị đƣợc tiếp úc với nguyên liệu mới nên dịch chiết thu đƣợc đậm đặc. Bã dƣợc liệu trƣớc khi ra kh i thiết bị đƣợc tiếp úc với dung môi mới nên bã dƣợc liệu đƣợc chiết kiệt.
So với phƣơng pháp chiết gián đoạn thì phƣơng pháp chiết liên tục có ƣu nhƣợc điểm sau:
u điểm
Năng suất làm việc cao, tiết kiệm thời gian chiết. hông phải lao động thủ công (tháo bã, nạp liệu). Dịch chiết thu đƣợc đậm đặc.
Dƣợc liệu đƣợc chiết kiệt. Dung môi ít tốn kém
Có thể tự động hóa, cơ giới hóa đƣợc quá trình.
hư c điểm
Thiết bị có cấu tạo phức tạp, đắt tiền. Vận hành phức tạp.
1 6 3 ột ố phư ng pháp tách chiết thông dụng
Tác c t bằn b n c t o let
Đây là phƣơng pháp chiết nóng b ng cách đun hồi lƣu dung môi với chất rắn một thời gian rồi rút ra. Dùng thiết bị này để chiết nhiều lần liên tục và tiết kiệm dung môi. Dung môi hữu cơ thƣờng dùng Ethanol, n-hexan C6H14, diclorometan…Ƣu điểm của phƣơng pháp này có thể thu hồi dung môi trực tiếp trên thiết bị chiết và có thể sử dụng lại cho quá trình chiết tiếp theo.
C t n m
Ngâm chất rắn vào dung môi trong một thời gian rồi chiết dung môi ra. Đây là phƣơng pháp đƣợc sử dụng rộng rãi nhất trong quá trình chiết thực vật bởi nó không đòi h i nhiều công sức và thời gian. Mẫu đƣợc ngâm với dung môi trong bình chiết khoảng 24 giờ, sau đó lấy ra đem đi chiết.
1 6 4 ột ố phư ng pháp tách chiết mới
1.6.4.1. Chiết b ng chất l ng quá tới hạn
Những năm gần đây phƣơng pháp chiết uất b ng chất l ng quá tới hạn (super – critical fluid extraction, SFE) cũng đƣợc áp dụng để chiết uất trong định tính cũng nhƣ công nghiệp các hợp chất tự nhiên.
Nguyên tắc của phƣơng pháp này nhƣ sau: trong điều kiện áp suất bình
thƣờng, khi nâng nhiệt độ một chất l ng tới điểm sôi của nó, chất l ng sẽ hóa hơi.
Tuy nhiên, nếu tiếp tục tăng nhiệt độ và đồng thời tăng áp suất của hệ lên quá một
nhiệt độ và một áp suất nào đó, ngƣời ta sẽ thu đƣợc một “chất l ng” đặc biệt gọi là
chất l ng quá tới hạn. Chất l ng này không giống với trạng thái l ng thông thƣờng
mà mang cả đặc tính của chất khí và chất l ng.
Chất l ng thông dụng nhất hiện nay là CO2 l ng quá tới hạn. CO2 có điểm tới hạn thấp, rẻ tiền, không độc hại và thân thiện với môi trƣờng, có thể thu hồi, không
làm tăng hiệu ứng nhà kính. hi chiết chiết uất các hoạt chất từ thiên nhiên, CO2 l ng quá tới hạn có lợi hơn các dung môi hữu cơ thông thƣờng ở chổ ít độc hại, nâng cao hiệu suất và không để lại dƣ lƣợng dung môi trong cao chiết. Ngoài ra quá trình chiết uất có thể tiến hành ở nhiệt độ thấp nên không làm biến đổi những thành phần kém bền với nhiệt độ.
Một trong những nhƣợc điểm của SFE chính là tính phân cực của CO2 l ng quá tới hạn. Ở các điều kiện chiết thông thƣờng, CO2 l ng quá tới hạn CO2 l ng quá tới hạn là một dung môi kém phân cực, do đó chỉ có thể dùng chiết các chất kém phân cực. Để cải thiện khả năng hòa tan các chất phân cực hơn, trong quá trình chiết uất, ngƣời ta thêm vào CO2 l ng quá tới hạn một lƣợng nhất định một dung môi phân cức (nhƣ methanol) để thay đổi tính phân cực của dung môi để chiết các chất phân cực hơn.
1.6.4.2. Chiết dƣới áp suất cao
Một kỹ thuật chiết hiện cũng đƣợc sử dụng trong chiết uất hiện đại là chiết dƣới áp suất cao (pressuri ed liquid e traction – PLE). hả năng hòa tan của các chất trong dung môi phụ thuộc nhiều vào nhiệt độ. hi nhiệt độ tăng, khả năng hòa tan các chất tăng. Vì thế, trong chiết uất, ngƣời ta có u hƣớng tăng nhiệt độ để giảm lƣợng dung môi sử dụng và giảm thời gian chiết. Tuy nhiên, trong điều kiện bình thƣờng, việc tăng nhiệt độ để chiết có giới hạn của nó là nhiệt độ sôi của dung môi. hi hóa hơi, dung môi không còn khả năng hòa tan các chất nữa. Để khắc phục điều này, ngƣời ta tiến hành chiết các chất dƣới áp suất cao dựa trên nguyên tắc: nhiệt độ sôi của chất l ng tăng khi áp suất tăng.
hi nhiệt độ tăng lên 10oC, khả năng hòa tan của dung môi tăng lên gấp rƣỡi. Trong chiết dƣới áp suất, dung môi chiết đƣợc đƣa tới nhiệt độ và áp suất gần với vùng tới hạn. Nhiệt độ và áp suất cao làm tăng khả năng hòa tan và khuếch tán của dung môi để cho việc chiết uất hiệu quả hơn. Nhiệt độ có thể thay đổi từ 80-2000C và áp suất có thể tới 150 bar tùy theo loại dung môi và chất cần chiết
So với SFE, PLE có sự linh hoạt hơn trong việc lựa chọn dung môi do đó có thể chiết các chất trong một giới hạn rộng hơn về độ phân cực. Các thiết bị cũng
không cần đạt áp suất cao nghiêm ngặt nhƣ SFE nên dễ dàng áp dụng thực thế trên qui mô lớn.
1.6.4.3. Tách chiết với hỗ trợ của vi sóng
Dƣới tác dụng của vi sóng, nƣớc trong tế bào thực vật bị nóng lên thật nhanh, áp suất bên trong tăng đột ngột làm các mô chứa dịch chiết bị vỡ ra, dịch chiết thoát ra bên ngoài, lôi cuốn theo hơi nƣớc sang hệ ngƣng tụ. Hiệu suất có thể b ng hoặc cao hơn những phƣơng pháp khác nhƣng thời gian cần chiết rất ngắn. Dịch chiết thu đƣợc có mùi tự nhiên. Sản phẩm phân hủy trong dịch chiết giảm đi. Tiết kiệm thời gian, năng lƣợng, giảm giá thành sản uất. Tuy nhiên chỉ áp dụng đƣợc cho các nguyên liệu có tuyến dịch chiết n m ngay trên bề mặt lá. Năng lƣợng chiếu ạ lớn sẽ làm cho một số cấu phần trong dịch chiết bị phân hủy.
1.6.4.4. Chiết với sự hỗ trợ của siêu âm
Trong quá trình chiết uất, đôi khi sóng siêu âm cũng đƣợc áp dụng để tăng hiệu quả chiết. Sóng siêu âm với tần số trên 20 H thƣờng đƣợc sử dụng. Sóng siêu âm có tác dụng làm tăng sự hòa tan của chất tan vào dung môi và tăng quá trình khuếch tán chất tan. Sóng siêu âm cƣờng độ cao cũng có thể phá vỡ cấu trúc tế bào, thúc đẩy quá trình chiết.
Chiết với sự hỗ trợ của sóng siêu âm thƣờng đƣợc sử dụng trong chuẩn bị mẫu phân tích thay cho phƣơng pháp ngâm lạnh hay chiết So hlet cổ điển. hi đó ngƣời ta nhúng bình chiết vào bể siêu âm có chứa nƣớc, sóng siêu âm phát ra từ các đầu phát sẽ truyền qua môi trƣờng nƣớc và đi vào hỗn hợp chiết. Trong chiết siêu âm, hỗn hợp chiết với dung môi phân cực sẽ nóng lên. Tuy nhiên, ngƣời ta cũng có thể gia nhiệt để quá trình chiết đƣợc nhanh hơn. Trong chiết uất ở qui mô lớn hơn, đầu phát siêu âm sẽ đƣợc nhúng trực tiếp vào bình chiết chứa nguyên liệu chiết. Do khả năng uyên sâu kém nên việc sử dụng thƣờng ở qui mô phòng thí nghiệm.
7 P ƣơn p áp tố ƣu óa bằng bề mặt đáp ứng [11]
Để tìm đƣợc điểm tối ƣu về hàm lƣợng Polyphenol, thì có rất nhiều phƣơng pháp nhƣ sử dụng đƣờng dốc nhất, bề mặt đáp ứng…Trong đó, có phƣơng pháp bề
mặt đáp ứng đƣợc sử dụng phổ biến do phƣơng pháp này cho kết quả nhanh và tƣơng đối chính xác.
Phƣơng pháp bề mặt đáp ứng RSM là một phƣơng pháp thống kê sử dụng các dữ liệu định lƣợng từ các thí nghiệm để ác định và giải thích nhiều biến phƣơng trình. RSM khám phá các mối quan hệ giữa các biến và giải thích một hay nhiều biến phản ứng. Phƣơng pháp này đã đƣợc giới thiệu bởi GEP Box và KB Wilson vào năm 1951.
Ý tƣởng chính của RSM là sử dụng một chuỗi các thí nghiệm đƣợc thiết kế để có đƣợc một phản ứng tối ƣu. Để làm điều này, Bo và Wilson đã đƣợc sử dụng một mô hình đa thức bậc hai. Mô hình này chỉ là xấp xỉ, nhƣng lại tƣơng đối dễ dàng áp dụng.
1.7.1. Nguyên tắc [10]
Trong trƣờng hợp chung, ngƣời ta gọi bề mặt đáp ứng, đại diện hình học hàm mục tiêu của một quá trình vật lí không gian-thời gian ngẫu nhiên cho những biến kích thích. Đặc tính đƣợc nghiên cứu, hay hàm mục tiêu Y là kết quả của sự chuyển đổi b ng một chức năng đáp ứng rõ ràng (hay còn gọi là chức năng chuyển đổi). Sự thay đổi giá trị của các biến đầu vào sẽ kéo theo sự thay đổi chức năng của hàm mục tiêu. Những mô hình thí nghiệm của bề mặt đáp ứng lƣu ý đến sự lựa chọn các biến kích thích, ác định các giai đoạn quan sát và tính toán sai số. Những biến đầu vào Xi (i=1,2…,n) cũng đƣợc gọi là những biến cơ sở. Chúng đƣợc đặc trƣng bởi một loạt các thông tin thống kê µj (j=1,2,…,p).
Trong trƣờng hợp chung, những biến Xi là những biến thay đổi theo không gian – thời gian.
Nói chung, hình thức rõ ràng của chuyển đổi này tùy thuộc và các biến cơ sở là không đƣợc biết đến và nghiên cứu về tính xấp xỉ đƣợc gọi là chức năng đáp ứng trở nên cần thiết. Thông thƣờng, nó xuất hiện trong một họ chức năng thƣờng là tuyến tính hoặc phi tuyến và đƣợc đặc trƣng bởi các thông số Xk (k=1,2,…l) một cách ngẫu nhiên hay ác định. Việc điều chỉnh mục tiêu phải dựa trên một cơ sở của những thí nghiệm (thí nghiệm vật lí hay số học) và một hệ mét cho việc tính toán
các sai số, nó cho phép ta suy ra đƣợc các thông số Xk. Sự biểu diễn hình học của chức năng đáp ứng dƣới dạng một đƣờng cong, một mặt phẳng gia tăng đƣợc gọi là bề mặt đáp ứng.
1.7.2. Công dụng của RSM
Xác định các mức yếu tố làm th a mãn đồng thời các thông số k thuật mong muốn.
Kết hợp tối ƣu hoá cho các yếu tố để cho ra kết quả mong muốn đạt đƣợc và mô tả kết quả tối ƣu đó.
Cho ra một kết quả đặc trƣng khi nó bị ảnh hƣởng bởi những sự thay đổi của các mức yếu tố vƣợt quá mức đang quan tâm.
Đạt đƣợc một sự hiểu biết về định lƣợng của hệ thống xử lí vƣợt qua vùng thử nghiệm.
Sản xuất các sản phẩm đặc trƣng trong vùng, ngay cả khi kết hợp với các yếu tố không chạy.
1.7.3. u, như c điểm của RSM [11]
u điểm:
Mang tính thực tế vì số liệu đƣợc lấy từ thực nghiệm.
Có thể áp dụng cho bất kì hệ thống nào có biến đầu vào và mục tiêu đầu ra. Đánh giá đƣợc tác động của các yếu tố ảnh hƣởng.
Thực hiện dễ dàng, nhanh chóng.
hư c điểm:
Chỉ mang tính gần đúng.
Phạm vi tác dụng bị giới hạn, mặt đáp ứng sẽ không có giá trị đối với những vùng khác ngoài dải yếu tố đang nghiên cứu.
C ƣơn II NGU ÊN VẬT LIỆU VÀ P ƢƠNG P ÁP NGHIÊN CỨU
NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu
Lá Trầu Không (Piper betle Linn) đƣợc thu hái trực tiếp tại vƣờn trồng trầu của ngƣời dân ở Thành phố Nha Trang, Khánh Hòa trong tháng 4/2014. Chỉ những lá đạt mức độ trƣởng thành mới đƣợc tuyển chọn. Nguyên liệu sau khi thu hái, đƣợc vận chuyển nhanh chóng về phòng thí nghiệm để tiến hành làm khô b ng không khí nóng ở nhiệt độ 50oC sử dụng tủ sấy có kiểm soát nhiệt độ (Dicell, XR60C, Belluno, Italy) đến khi đạt đƣợc độ ẩm khoảng 10%, sau đó nguyên liệu đƣợc nghiền thành kích thƣớc nh và đƣợc sàng qua lỗ có kích thƣớc (2 mm), gân lá và những phần lá có kích thƣớc lớn hơn lỗ sàng bị loại b . Nguyên liệu khô đƣợc bao gói trong túi nhựa, hút chân không và đƣợc bảo quản đông ở nhiệt độ - 66oC cho đến khi sử dụng.
2.2. Hóa chất
Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu đều đạt hạng phân tích. Folin- Ciocalteu’s, Na2CO3, AlCl3, NaOH, NaNO2, K3(Fe[CN]6), a xít trichloracetic (TCA), NaH2PO4, Na2HPO4, Ethanol mua của hãng Merck (Đức). 1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl (DPPH), a xít gallic, quecertin mua từ Sigma Aldride (Mỹ).
2.3. Thi t k thí nghiệm tố ƣu t eo p ƣơn p áp bề mặt đáp ứng
Sau khi khảo sát ảnh hƣởng của bốn thông số quan trọng ảnh hƣởng đến điều kiện chiết polyphenol từ lá Trầu Không bao gồm: Nhiệt độ, thời gian, tỉ lệ dung môi/nguyên liệu và nồng độ ethanol. Tuy nhiên, những nghiên cứu trên chỉ khảo sát ảnh hƣởng của từng yếu tố riêng rẽ (thí nghiệm yếu tố từng phần) mà không khảo sát đƣợc ảnh hƣởng đồng thời của các yếu tố. Vì vậy, bố trí thí nghiệm nh m đánh giá ảnh hƣởng tổng hợp (thí nghiệm yếu tố toàn phần) là cần thiết để thiết lập đƣợc điều kiện chiết tối ƣu cho hàm lƣợng polyphenol cao nhất. Để đạt đƣợc mục tiêu này, phƣơng pháp bề mặt đáp ứng (Response surface methodology) đƣợc lựa chọn để tối ƣu hóa điều kiện chiết polyphenol từ lá Trầu Không.
Mục tiêu của nghiên cứu này là nh m ác định đƣợc điều kiện chiết tối ƣu lá Trầu Không để thu đƣợc dịch chiết có hàm lƣợng polyphenol cao nhất. Theo đó, các biến độc lập bao gồm:Thời gian chiết (X1), Nhiệt độ chiết (X2), tỉ lệ dung môi/nguyên liệu chiết (X3) và nồng độ ethanol (X4). Biến phụ thuộc (hàm mục tiêu) là hàm lƣợng polyphenol (Y).
Miền khảo sát tối ƣu của các biến độc lập đƣợc ác định dựa vào kết quả nghiên cứu của Lê Thị Nhã Uyên (2014). Số thí nghiệm cần tiến hành là 27 thí nghiệm (Bảng 2.1), trong đó: 16 (24) thí nghiệm ở hai mức (trên và dƣới), 8 (2 × 4) thí nghiệm ở điểm sao và 3 thí nghiệm ở tâm. Mô hình toán học mô tả ảnh hƣởng của các biến độc lập đối với biến phụ thuộc có dạng hàm đa thức bậc hai nhƣ sau:
