Dung môi có vai trò rất quan trọng trong quá trình tách chiết polyphenol từ thực vật. Độ phân cực của dung môi sẽ ảnh hƣởng đến độ hòa tan của các hợp chất polyphenol vào dung môi. Đồng thời, việc lựa chọn dung môi sẽ ảnh hƣởng trực tiếp đến công đoạn tinh sạch dịch chiết. Việc lựa chọn dung môi dựa trên hai tiêu chí: loại chất chủ đạo muốn tách và sự thuận tiện cho công đoạn tinh sạch về sau.
Mỗi loại chất khác nhau trong nhóm phenolic sẽ thích hợp với những dung môi khác nhau. Phenolic có Glycosid hóa thƣờng tan nhiều trong nƣớc nên dung môi thƣờng sử dụng là nƣớc và hỗn hợp nƣớc với methanol hoặc aceton hoặc ethanol (Rice-Evans và cộng sự, 1997). Ngƣợc lại, phenolic ít phân cực nhƣ isoflavanes, flavanones…thƣờng tan nhiều hơn trong dung môi kị nƣớc.
Ethanol, methanol hòa tan tốt trong các hợp chất polyphenol và rất dễ đƣợc loại b ra kh i dịch chiết trong công đoạn tinh sạch. Các loại dung môi có tính phân cực lớn nhƣ nƣớc hay dung môi không phân cực nhƣ chloroform hoặc hexane thƣờng khó thu hồi lại sau khi chiết (Liu và cộng sự, 2000,) lƣợng tạp chất lớn rất khó tinh lọc.
1.5.3. Tỷ lệ dung môi/nước
Polyphenol là một nhóm các hợp chất vô cùng đa dạng, có thể tồn tại ở dạng tự do hoặc ở dạng liên kết với các đƣờng dạng glycoside. Để tách đƣợc polyphenol ở dạng glycoside, nƣớc thƣờng đƣợc thêm vào dung môi. Trong các loại nguyên liệu khác nhau, tỷ lệ hợp chất phenol glycoside hóa khác nhau do đó tùy thuộc vào loại nguyên liệu mà tỉ lệ dung môi/nƣớc cần đƣợc ác định cho phù hợp để tăng hiệu quả chiết cũng nhƣ quyết định chi phí của cả quá trình.
1.5.4. Thời gian chiết
Thời gian chiết là một nhân tố ảnh hƣởng tới sự thu hồi polyphenol cũng nhƣ chất lƣợng của dịch chiết. Thời gian chiết ngắn cho hiệu suất thu hồi thấp, thời gian chiết quá dài khiến polyphenol dễ bị oxi hóa và làm giảm hiệu suất sử dụng thiết bị. Thời gian chiết thay đổi từ 1 phút đến 24 giờ (Shahidi và Nack, 2004).
1.5.5. pH
Việc thêm acid vào dung môi chiết quyết định trạng thái ổn định của hợp chất phenolic nhƣ anthocyanins (Hợp chất bền trong môi trƣờng acid, ở pH cao, nó bị biến đổi), ảnh hƣởng đến khả năng hòa tan của các polimer thủy phân nhƣ lignin, hydroxycinnamic acid và procyanidins, và cuối cùng có thể làm tăng mức độ thẩm thấu của thành tế bào từ đó tăng độ hòa tan của polyphenol.
Anthocyanins thƣờng đƣợc chiết trong hệ thống dung môi đã acid hóa, thƣờng sử dụng là methanol và aceton acid hóa. Hệ thống dung môi acid hóa phá hủy màng tế bào, đồng thời hòa tan anthocyanin Acid cũng tạo điều kiện thuận lợi cho sự tạo thành muối flavilium chloride, tạo sự ổn định của anthocyanins. Acid thƣờng sử dụng trong quá trình chiết là HCl, tartaric, acid citric hoặc triflourroacetic
1.6. Các kỹ thuật chi t rút polyphenol từ lá Trầu [1] [14] [17]
Có rất nhiều yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình chiết nhƣ loại dung môi, nhiệt độ chiết, bản chất của chất tan, nồng độ dung môi…các yếu tố này quyết định hiệu suất của quá trình chiết.
Nguyên liệu trƣớc khi chiết uất cần kiểm tra về mặt thực vật em có đúng loài, đôi khi đúng thứ hay chủng mà chúng ta cần hay không. Cần ghi r nơi thu hái, thời gian thu hái. Tùy theo trƣờng hợp mà đặt vấn đề thời vụ thu hái, để đảm bảo hoạt chất mong muốn có hàm lƣợng cao nhất. Nguyên liệu sau đó có thể đƣợc làm khô hoặc để tƣơi mà chiết. Nhiều hoạt chất rắn rất dễ bị biến đổi trong quá trình làm khô hoặc ngay khi còn tƣơi nếu không ử lý để diệt en yme. ích thƣớc của bột nguyên liệu cũng là yếu tố quan trọng ảnh hƣởng đến chất lƣợng và hiệu quả của quá trình chiết.
Dung môi dùng để chiết các hợp chất kh i hợp chất thiên nhiên rất đa dạng và thay đổi tùy theo bản chất của mỗi loại hợp chất thiên nhiên. Vì vậy, cơ sở để lựa chọn dung môi chiết là tính phân cực của hợp chất chứa trong hợp chất thiên nhiên và của dung môi.
Dung môi chiết tùy theo từng loại hợp chất mà chọn cho thích hợp. Về nguyên tắc, để chiết các chất phân cực (các glycosic, các muối của alcaloid, các hợp
chất polyphenol…) thì phải sử dụng các dung môi phân cực. Để chiết các chất kém phân cực (chất béo, tinh dầu, carotenoid, các triterpen và các steroid tự do…) thì phải sử dụng các dung môi kém phân cực. Trên thực tế, cồn với các nồng độ cồn khác nhau là dung môi hay đƣợc dùng. Cồn có thể hòa tan đƣợc nhiều nhóm hoạt chất, không độc rẻ tiền và dễ kiếm. Trong một vài trƣờng hợp, dƣợc liệu tƣơi đƣợc thả từ từ trong cồn tƣơi vừa để diệt en yme vừa để hòa tan hoạt chất.
1 6 1 h n oại
Có nhiều cách phân loại, dựa vào các yếu tố khác nhau: 1.6.1.1. Dựa vào nhiệt độ
Có hai cách chiết: chiết ở nhiệt độ thƣờng và chiết nóng. Mỗi cách chiết có dung môi và thiết bị riêng.
Chiết ở nhiệt độ thƣờng: có 2 cách là ngâm kiệt và ngâm phân đoạn. Phƣơng pháp ngâm kiệt cho kết quả tốt hơn vì chiết đƣợc nhiều hoạt chất và tiết kiệm đƣợc dung môi.
Chiết nóng: thƣờng áp dụng chiết liên tục hoặc hồi lƣu đối với dung môi dễ bay hơi.
1.6.1.2. Dựa vào chế độ làm việc Gián đoạn Gián đoạn
Bán liên tục Liên tục
1.6.1.3. Dựa vào chiều chuyển động tƣơng hỗ giữa hai pha, có các phƣơng pháp Ngƣợc dòng Ngƣợc dòng
Xuôi dòng Chéo dòng
1.6.1.4. Dựa vào áp suất làm việc, có các phƣơng pháp p suất thƣờng (áp suất khí quyển) p suất thƣờng (áp suất khí quyển)
p suất giảm (áp suất chân không) p suất cao (làm việc có áp lực)
1.6.1.5. Dựa vào những biện pháp k thuật đặc biệt
Có thể rút ngắn đƣợc thời gian chiết b ng các phƣơng pháp chiết sau: Phƣơng pháp siêu âm
Phƣơng pháp tạo dòng oáy Phƣơng pháp mạch nhịp…
1 6 2 ột ố phư ng pháp chiết uất
hi chiết uất, quá trình chiết uất chủ yếu ảy ra ở hai khu vực: bên trong nguyên liệu và giữa các lớp dung môi. Trong đó quá trình ảy ra bên trong nguyên liệu có ảnh hƣởng quyết định và phụ thuộc vào bản chất nguyên liệu (cấu trúc, tính chất lý hóa…). Các phƣơng pháp chiết uất thƣờng chỉ tác động đến yếu tố bên ngoài, nh m đạt đƣợc hiệu quả cao trong thời gian ngắn đối với mỗi loại nguyên liệu. Dƣới đây là một số phƣơng pháp chiết thƣờng gặp.
1.6.2.1. Phƣơng pháp chiết uất gián đoạn
P ƣơn p áp n m
Phƣơng pháp ngâm là phƣơng pháp đơn giản nhất và đã có từ cổ ƣa.
iến h nh
Sau khi chuẩn bị nguyên liệu, ngƣời ta đổ dung môi vào ngập nguyên liệu trong bình chiết uất, sau một thời gian ngâm nhất định, rút lấy dịch chiết (lọc hoặc gạn) và rửa nguyên liệu b ng một lƣợng dung môi thích hợp. Để tăng cƣờng hiệu quả chiết uất, có thể tiến hành khuấy trộn b ng cách khuấy hoặc rút dịch chiết ở dƣới rồi đổ lại lên trên (tuần hoàn cƣỡng bức dung môi).
Có nhiều cách ngâm: có thể ngâm t nh hoặc ngâm động, ngâm nóng hoặc ngâm lạnh, ngâm một lần hay nhiều lần (còn gọi là ngâm phân đoạn hay ngâm nhiều mẻ).
u điểm
Đây là phƣơng pháp đơn giản nhất, dễ thực hiện, thiết bị đơn giản, rẻ tiền.
hư c điểm
Nhƣợc điểm chung của phƣơng pháp chiết uất gián đoạn: năng suất thấp, thao tác thủ công (giai đoạn tháo bã và nạp liệu).
Nếu chỉ chiết một lần thì không chiết kiệt đƣợc hoạt chất trong nguyên liệu Nếu chiết nhiều lần thì dịch chiết loãng, tốn dung môi, tốn thời gian chiết.
P ƣơn p áp n m k ệt
Sau khi chuẩn bị nguyên liệu, ngâm nguyên liệu vào bình dung môi trong bình ngâm kiệt. Sau một khoảng thời gian nhất định (tùy từng loại nguyên liệu), rút nh giọt dịch chiết ở phía dƣới, đồng thời bổ sung thêm dung môi ở phía trên b ng cách cho dung môi chảy rất chậm và liên tục qua lớp nguyên liệu n m yên (không đƣợc khuấy trộn). Lớp dung môi trong bình chiết thƣờng đƣợc để ngập bề mặt nguyên liệu khoảng 3-4 cm.
g m iệt đơn giản: Là phƣơng pháp ngâm kiệt luôn sử dụng dung môi mới để chiết đến kiệt hoạt chất trong nguyên liệu.
g m iệt ph n đoạn tái ng m iệt : Là phƣơng pháp ngâm kiệt có sử dụng dịch chiết loãng để chiết mẻ mới (nguyên liệu mới) hoặc để chiết các các mẻ có mức độ chiết kiệt khác nhau.
u điểm
Dƣợc liệu đƣợc chiết kiệt.
Tiết kiệm đƣợc dung môi (tái ngâm kiệt).
hư c điểm
Có nhƣợc điểm chung của phƣơng pháp chiết uất gián đoạn: Năng suất thấp, lao động thủ công.
Cách tiến hành phức tạp hơn so với phƣơng pháp ngâm. Tốn dung môi (ngâm kiệt đơn giản).
1.6.2.2. Phƣơng pháp chiết uất bán liên tục
Còn gọi là phƣơng pháp chiết uất nhiều bậc, phƣơng pháp chiết nhiều dòng tƣơng đối hay phƣơng pháp chiết ngƣợc dòng gián đoạn.
n .3. ệ t ốn t t bị c t uất bán l n tục
Phƣơng pháp này có sử dụng một hệ thống thiết bị gồm nhiều bình chiết khác nhau, có thể mắc thành một dãy gồm 4-16 bình chiết nối tiếp nhau.Ở đây, quá trình coi nhƣ ngƣợc chiều tƣơng đối vì thực tế nguyên liệu không chuyển động.
iến h nh
Lúc đầu, nguyên liệu và dung môi đƣợc nạp trong tất cả các thiết bị, nguyên liệu đƣợc ngâm vào dung môi trong một khoảng thời gian ác định (tùy thuộc vào nguyên liệu và dung môi). Lúc này nguyên liệu và dung môi đều không chuyển động. Sau đó dịch chiết đƣợc chuyển tuần tự từ thiết bị này sang thiết bị khác. Hệ thống tổ hợp kín các bình chiết này cho phép đóng ngắt một cách có chu k một trong những thiết bị ra kh i hệ thống tuần hoàn, cho phép tháo bã nguyên liệu ở bình đã đƣợc chiết kiệt rồi nạp nguyên liệu mới. Sau đó thiết bị này lại đƣợc đƣa vào hệ thống tuần hoàn và dịch chiết đậm đặc nhất đƣợc dẫn qua nó mà dịch chiết này vừa đi qua tất cả các thiết bị còn lại. Tiếp theo, lại đóng ngắt một thiết bị kế tiếp mà trƣớc đó dung môi mới vừa đƣợc dẫn qua. Số thiết bị các nhiều thì quá trình ảy ra càng gần với quá trình liên tục. Ở đây, bã nguyên liệu trƣớc khi ra kh i hệ thống thiết bị sẽ đƣợc tiếp úc với dung môi mới nên nguyên liệu sẽ đƣợc chiết kiệt. Dịch chiết trƣớc khi ra kh i
hệ thống sẽ đƣợc tiếp úc với nguyên liệu mới nên nên dịch chiết thu đƣợc sẽ đậm đặc nhất. Nhƣ vậy có thể nói quá trình ảy ra theo nguyên tắc “dung môi mới tiếp úc với nguyên liệu cũ và dƣợc liệu mới tiếp úc môi cũ”. Trong phƣơng pháp này, quá trình ảy ra gần với quá trình ngƣợc chiều, do đó phƣơng pháp này còn đƣợc gọi là phƣơn pháp chiết ngƣợc chiều tƣơng đối.
u điểm (so với phƣơng pháp chiết gián đoạn)
Dịch chiết đậm đặc.
Nguyên liệu đƣợc chiết kiệt.
hư c điểm
Hệ thống thiết bị cồng kềnh, chiếm nhiều diện tích lắp đặt. Vận hành phức tạp.
Thao tác thủ công.
hông tự động hóa quá trình đƣợc. 1.6.2.3. Phƣơng pháp chiết uất liên tục
iến h nh
Phƣơng pháp này đƣợc thực hiện trong những thiết bị vận hành liên tục. Ở đây, nguyên liệu và dung môi liên tục đƣợc đƣa vào và chuyển động ngƣợc chiều nhau trong thiết bị. Nguyên liệu di chuyển đƣợc trong thiết bị là nhờ cơ cấu vận chuyển chuyên dùng khác nhau. Dịch chiết trƣớc khi ra kh i thiết bị đƣợc tiếp úc với nguyên liệu mới nên dịch chiết thu đƣợc đậm đặc. Bã dƣợc liệu trƣớc khi ra kh i thiết bị đƣợc tiếp úc với dung môi mới nên bã dƣợc liệu đƣợc chiết kiệt.
So với phƣơng pháp chiết gián đoạn thì phƣơng pháp chiết liên tục có ƣu nhƣợc điểm sau:
u điểm
Năng suất làm việc cao, tiết kiệm thời gian chiết. hông phải lao động thủ công (tháo bã, nạp liệu). Dịch chiết thu đƣợc đậm đặc.
Dƣợc liệu đƣợc chiết kiệt. Dung môi ít tốn kém
Có thể tự động hóa, cơ giới hóa đƣợc quá trình.
hư c điểm
Thiết bị có cấu tạo phức tạp, đắt tiền. Vận hành phức tạp.
1 6 3 ột ố phư ng pháp tách chiết thông dụng
Tác c t bằn b n c t o let
Đây là phƣơng pháp chiết nóng b ng cách đun hồi lƣu dung môi với chất rắn một thời gian rồi rút ra. Dùng thiết bị này để chiết nhiều lần liên tục và tiết kiệm dung môi. Dung môi hữu cơ thƣờng dùng Ethanol, n-hexan C6H14, diclorometan…Ƣu điểm của phƣơng pháp này có thể thu hồi dung môi trực tiếp trên thiết bị chiết và có thể sử dụng lại cho quá trình chiết tiếp theo.
C t n m
Ngâm chất rắn vào dung môi trong một thời gian rồi chiết dung môi ra. Đây là phƣơng pháp đƣợc sử dụng rộng rãi nhất trong quá trình chiết thực vật bởi nó không đòi h i nhiều công sức và thời gian. Mẫu đƣợc ngâm với dung môi trong bình chiết khoảng 24 giờ, sau đó lấy ra đem đi chiết.
1 6 4 ột ố phư ng pháp tách chiết mới
1.6.4.1. Chiết b ng chất l ng quá tới hạn
Những năm gần đây phƣơng pháp chiết uất b ng chất l ng quá tới hạn (super – critical fluid extraction, SFE) cũng đƣợc áp dụng để chiết uất trong định tính cũng nhƣ công nghiệp các hợp chất tự nhiên.
Nguyên tắc của phƣơng pháp này nhƣ sau: trong điều kiện áp suất bình thƣờng, khi nâng nhiệt độ một chất l ng tới điểm sôi của nó, chất l ng sẽ hóa hơi. Tuy nhiên, nếu tiếp tục tăng nhiệt độ và đồng thời tăng áp suất của hệ lên quá một nhiệt độ và một áp suất nào đó, ngƣời ta sẽ thu đƣợc một “chất l ng” đặc biệt gọi là chất l ng quá tới hạn. Chất l ng này không giống với trạng thái l ng thông thƣờng mà mang cả đặc tính của chất khí và chất l ng.
Chất l ng thông dụng nhất hiện nay là CO2 l ng quá tới hạn. CO2 có điểm tới hạn thấp, rẻ tiền, không độc hại và thân thiện với môi trƣờng, có thể thu hồi, không
làm tăng hiệu ứng nhà kính. hi chiết chiết uất các hoạt chất từ thiên nhiên, CO2 l ng quá tới hạn có lợi hơn các dung môi hữu cơ thông thƣờng ở chổ ít độc hại, nâng cao hiệu suất và không để lại dƣ lƣợng dung môi trong cao chiết. Ngoài ra quá trình chiết uất có thể tiến hành ở nhiệt độ thấp nên không làm biến đổi những thành phần kém bền với nhiệt độ.
Một trong những nhƣợc điểm của SFE chính là tính phân cực của CO2 l ng quá tới hạn. Ở các điều kiện chiết thông thƣờng, CO2 l ng quá tới hạn CO2 l ng quá tới hạn là một dung môi kém phân cực, do đó chỉ có thể dùng chiết các chất kém phân cực. Để cải thiện khả năng hòa tan các chất phân cực hơn, trong quá trình chiết uất, ngƣời ta thêm vào CO2 l ng quá tới hạn một lƣợng nhất định một dung môi phân cức (nhƣ methanol) để thay đổi tính phân cực của dung môi để chiết các chất phân cực hơn.
1.6.4.2. Chiết dƣới áp suất cao
Một kỹ thuật chiết hiện cũng đƣợc sử dụng trong chiết uất hiện đại là chiết dƣới áp suất cao (pressuri ed liquid e traction – PLE). hả năng hòa tan của các chất trong dung môi phụ thuộc nhiều vào nhiệt độ. hi nhiệt độ tăng, khả năng hòa tan các chất tăng. Vì thế, trong chiết uất, ngƣời ta có u hƣớng tăng nhiệt độ để giảm lƣợng dung môi sử dụng và giảm thời gian chiết. Tuy nhiên, trong điều kiện bình thƣờng, việc tăng nhiệt độ để chiết có giới hạn của nó là nhiệt độ sôi của dung môi. hi hóa hơi, dung môi không còn khả năng hòa tan các chất nữa. Để khắc phục điều này, ngƣời ta tiến hành chiết các chất dƣới áp suất cao dựa trên nguyên tắc: nhiệt độ sôi của chất l ng tăng khi áp suất tăng.
hi nhiệt độ tăng lên 10oC, khả năng hòa tan của dung môi tăng lên gấp rƣỡi. Trong chiết dƣới áp suất, dung môi chiết đƣợc đƣa tới nhiệt độ và áp suất gần với vùng tới hạn. Nhiệt độ và áp suất cao làm tăng khả năng hòa tan và khuếch tán của dung môi để cho việc chiết uất hiệu quả hơn. Nhiệt độ có thể thay đổi từ 80-2000C và áp suất có thể tới 150 bar tùy theo loại dung môi và chất cần chiết
So với SFE, PLE có sự linh hoạt hơn trong việc lựa chọn dung môi do đó có