IV. TÀI LIỆU THAM KHẢO
(Panax vietnamensis Haet Grushv.)
Nguyền Trung Thành*, Lẽ Văn cản
Trường Đại học KHTN, Đại học Quốc gia Hà Nội
Paek Kee Youep Đại học Quốc gia Chungbuk, Hàn Quốc
MỞ ĐẦU
Cây sâm Việt Nam (sâm Ngọc Linh, sâm K5, củ ngãi rọm con) thuộc họ Nhãn sâm (Araliaceae) đã được sử đụng trong dân gian như một vị thuốc dấu của đồng bào Xê-Đăng. Năm 1973, đoàn điều tra dược liệu Ban dân y khu 5 do dược sĩ Đào Kim Long và Nguyễn Châu Giang hướng dẫn, đã phát hiện một loài
Panax mọc hoang thành quần thề ở độ cao 1.800 m tại Kon Tum. Bắt đầu từ năm 1974, loài sâm mới này được gọi với tên sâm K5 để đánh dấu bước phát hiện lịch sử tại vùng liên khu 5 [3,4],
Đi cùng với thời gian cày sâm Ngọc Lĩnh đã được biết về tác dụng phòng chữa bệnh, tăng lực và sinh thích nghi (antistress), phục hồi sự suy giảm chức năng giúp cho tinh trạng của cơ thể trờ lại binh thường mà khái niẹm của y học cổ truyền gọi íà "hòi dương '. Tac dụng chống lão hóa, kháng các độc tố gây hại te bào, giúp kéo dải sự sống của tế bào, tái tạo các tế bào mới. Tác dụng kích thích điều hòa cơ chế miễn dịch, tảng sức đề kháng của cơ thể, phòng và chống lại một số bệnh ung thư Do dược tính quý giá cùa cây sâm nên giá thành lên tới hàng triệu đồng/củ. Trong nhiều năm qua người dân địa phương đã sán lùng khai thác một cách ồ ạt vô tội vạ, không có kế hoạch bào vệ, số lượng ngày cảng trờ nên khan hiếm và đã đến mức báo động.
Nhu cầu về sử dụng sâm và chiết xuất các hoạt chất của chủng đã tăng nhanh theo thời gian trên toàn thế giới. Nhưng đẻ thu hoạch được rễ sâm bằng phương pháp trồng trên đồng ruộng thi phải mất từ 4-6 năm vâ nhân công lao động cũng đã làm cho giá thành tăng lện rạt cao [7], Ngoài ra việc điều khiẻn các loại dịch bệnh, sự kháng các loại thuéc trừ sãụ cũng là một vấn đè nghiêm trọng [11], Trong những năm gần đây, việc ứng dụng cõng nghệ nuôi cấy tế bào thực vật đã rát thành công trọng sàn xuất các sản phẩm trao đỗi chát thứ cáp, bao gồm các nguyên liệụ thô trong dược phẩm, các sẳc tồ và cạc hợp chát khác [2,3]. Sản phẩm ginsenosides thu được nhiều kểt quả thật đáng tự hào thõng qua nuõi cấy tế bào thực vật
[6-12].
Trong bài báo này chủng tôi giới thiệu kết quả nghiên cứu về sự ảnh hường của một số nhân tố lý, hóa lên sự sinh trường và phát triển rễ bất định của sâm Ngọc Linh (P. vietnamensis Ha et Grushv )
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁPSự hình thành và tăng trường của mô sẹo Sự hình thành và tăng trường của mô sẹo
Rễ sâm Ngọc Linh tươi 4-5 năm tuồi thu tại núi Ngọc Linh, tỉnh Quàng Nam (Hình 1A), được rửa sạch bằng nước lã từ 3-5 phút, sau đó khừ trùng bằng cổn 70% trong 2 phút, cuõi cùng khử trùng trong dung địch sodium hypochlorite 1 - 5% và sửa lại bằng nước lã vô trùng 3 lân. Mầu được căt thành tửng miêng nhỏ có kích thứớc từ 0,2 - 0,5 cm và được nuôi cấy trong mõi trường MS cơ bản. Điều kiện nuôi cậy trong bóng tồi ờ nhiệt độ 23 ± 2 °c , sau 4 tuần nuôi cáy mõ sẹo đã được hình thành trên môi trường rắn MS, bổ sung 1 mg/L 2,4D (2,4 dichlorophenoxy acetic axit).
Nuôi cắy rễ bất định
Rễ bất định đã hình thành tử mõ sẹo sau 6 tuần nuôi cấy trẽn môi trường MS bồ sung 30 g/L đường sucrose, 10 g/L agar (Công ty sản xuất đồ hộp Quảng Ninh). Hai loại auxin được sử dụng trong thi nghiệm
để tạo ra rễ bất định IBA (indole 3-butyric axit) và NAA (naphthalene acetic axit) với nông độ 0, 1, 2, 4, 6 mg/L.
NHỮNG VẤN ĐỂ NGHIÊN c ứ u c ơ BẢN TRONG KHOA HỌC s ự SỐNG 829
Bảng 1. Anh hưởng của nòng độ 2,4D đến sự hình thành và phát của mô sẹo
2,4-D mg/L TLK của mô sẹo (g/L) Diễn biến quá trinh hinh thánh mò sẹo______________________________ 0,0 0,0 Khòng hình thành mô sẹo, rễ sâm chuyển sang màu váng
0,5 9,6 Mô sẹo hinh thành, về sau chuyẻn sang màu xanh và dần dần trờ nên rán 1.0 13,5 Mô sẹo hình thành, phát triẻn tốt, có màu vàng nhạt, xốp hơi bờ
2.0 7,5 Mô sẹo hinh thánh, hơi rắn vè sau chuyển sang màu nảu
Bảng 2. Ành hường của nòng độ đường lên của rễ bất định Nhân sâm
Nồng độ đường Trọng lượng khô _______________ Sán phảm ginsenoside (mg/g TLK)__________ __ (9^L) (g/100ml) Rb Rg Tổng số 0 1,03 ± 0,64 2,05 ±0,12 4.98 ±0,08 7,03 ±0,31 10 1,22 ± 0 ,21 1 95 ±0,21 5.05 ±0,13 7,11 ±0,22 30 1 36 ± 0 15 1 .1 3 *0 ,1 5 5,89 i 0,21 8.12 ±0,15 50 1,75 ± 0,17 1 87 ± 0 1 1 5.43 ±0,15 8.37 ± 0,12 70 1 ,5 7 *0 .1 2 1 05 ± 0 20 6 22 ± 0 17 8.16 ±0,25 90 1 24 ± 0 19 1,35 ±0,09 5 54 ± 0 10 7,65 ±0.13
Chiết xuất và xác định hàm lượng ginsenosides
Rễ bất định đã thu hoạch, sửa sạch và sấy khô ờ nhiệt độ 60 oC trong 7 giờ. Quá trình chiết suất, xác định hàm lượng ginsenosides có trong rễ sâm đã tiến hành theo mô tả [9, 10]. Các thi nghiệm đều đã tiến hành cùng điều kiện như nhau và có 3 lần lặp lại.
KỂT QUẢ, T H Ả O L U Ậ N
Ảnh của nòng độ 2,4D đến sự hình thành mô sẹo
Trên môi trưởng nuôi cấy MS cơ bản, mô sẹo đã hinh thành sau 4 tuần nuôi cấy. Kết quả thu được khi không sung 2,4D vào môi trường nuôi cấy thi các mẫu không hình thành mô sẹo (Hình 1B). Khi tăng nồng độ từ 0 đến 1 mg/L 2,4D thi mô sẹo hình thành và phát triển tốt (Hĩnh 1C), ở nòng độ 1 mg/L mô sẹo có máu vàng nhạt, xốp, hơi mềm, trọng lượng khô thu được 13,5 g/L (Bảng 1). Tiếp tục tăng nồng độ đến 2 m/L, mô sẹo phát triển chậm lại, hơi rắn và ngả sang màu vảng (Hinh 1).
Trong nuôi cấy mô, tể bào thực vật thì auxin được coi lá nhân tố cần thiết cho sự hinh thành mộ sẹọ, tuy nhiên điều này cũng cho thầy nếu sử dụng nồng độ không thích hợp thi sẽ ảnh hường không tột đến sự hinh thành mo sẹo. Đặc biệt ờ các nồng độ auxin cao sẽ ức ché quá trinh hình thành mô sẹo, điẽu náy đã được chứng minh khi nghiên cứu quá trinh phát sinh phôi của Picea abies và p ginseng [2, 5], Trong nuôi cấy p. ginseng, Son và cộng sự [8] cũng nhận được kết quả tương tự vợi auxin 2,4D ợ nồng độ 1.0 mg/L lả tối ưu cho sự hình thành mô sẹo. Furuya và cộng sự [5] đã tình thấy rằng 2,4D là cằn thiết chọ sự hinh thành và phát triển mô sẹo của p. ginseng, nhưng nồng độ của 2,4D cao có thể gây ức chẽ sự sinh trường. Thi nghiệm này cho thấy rằng 2,4D là auxin thích hợp cho sự hình thành và phát triển của mô sẹo. Như vậy kết quả thu được ờ đây cho thấy nồng độ 1 mg/L 2,4D là tối ưu cho sự hinh thành và phát triển mô sẹo của sâm Ngọc Linh.
Ảnh hường cùa auxin đến sự hình thành rễ bất định
Mô sẹo phát triền ổn định, sau đó được nuôi cấy trên mội trướng MS cơ bản. Hai loại auxin được sử dụng trong thi nghiệm để tạo ra rễ bất định IBA và NAA với nồng độ 0, 1, 2, 4, 6 mg/L. Kẽt quả thu được sau 6
tuần nuôi cấy rễ bất định hlnh thành trẽn mô sẹo ờ cả hai loại auxin. Tỳ lệ rễ bãt định hình thánh Ờ_IBA
(89%) (Hình 1D), còn ơ NAA (76%) (Hình 1E). đặc biệt ờ nồng độ auxin thấp đã không hình thành rễ bất
định. Số rễ bất định hình thảnh cao nhất nồng độ 2 mg/L IBA và 4 nrtg/L NAA. Quan sát sự hình thành rẽ
bất định có 4 giai đoạn chinh: a) sự hình thành các vị trí mõ phân sinh, b) sự phân chia các tẽ bào non, c)
sự phân chia các tể bảo già để hình thành nên các cơ quan và các mô phản sinh rê, d) sự phát triên của
rễ từ mô phân sinh (Hình 1D, E, F).
