ELISA
3.6.3.1 Khái niệm
ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) là một kĩ thuật xét nghiệm miễn dịch dựa trên cơ chế kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể (kháng thể có gắn enzyme) và dùng cơ chất đặc hiệu với enzyme để phát hiện phức hợp kháng nguyên - kháng thể.
Đây là một trong các phương pháp quan trọng để xác định kháng thể Gumboro trong huyết thanh. Phản ứng ELISA có nhiều loại: phản ứng ELISA trực tiếp và phản ứng ELISA gián tiếp. Trong thí nghiệm chúng tôi sử dụng phương pháp ELISA gián tiếp để phát hiện hàm lượng kháng thể Gumboro trong huyết thanh của gà thí nghiệm.
3.6.3.2 Nguyên lý chung
Thực chất của phản ứng ELISA là sử dụng kháng thể hoặc kháng kháng thể có gắn enzyme cho kết hợp trực tiếp hoặc gián tiếp với kháng nguyên. Sau đó cho cơ chất vào. Nếu kháng thể tương ứng với kháng nguyên thì kháng thể hay kháng kháng thể có gắn enzyme không bị rửa trôi. Enzyme sẽ giải phóng cơ chất tạo nên màu. Khi so màu bằng quang phổ sẽ xác định được mật độ quang học, qua đó sẽ định lượng được mức độ của phản ứng.
3.6.3.3 Nguyên lý hoạt động của kit IBDV Antibody
IBDV Antibody test kit hoạt động dựa trên nền tảng của kĩ thuật ELISA gián tiếp. Kháng nguyên đặc hiệu của virus gây bệnh viêm túi Fabricius truyền nhiễm được gắn vào đáy giếng của 1 vỉ gồm 96 giếng. Khi ủ mẫu trong giếng kiểm tra, kháng thể đặc hiệu của virus Gumboro sẽ gắn kết với kháng nguyên đã được gắn ở đáy giếng và không bị rửa trôi sau hoạt động rửa để loại bỏ những
thành phần không kết hợp. Tiếp theo, conjugate được thêm vào để kết hợp với mọi kháng thể của gà. Conjugate không kết hợp sẽ bị rửa trôi và cơ chất đặc hiệu với enzyme được thêm vào. Màu của hỗn dịch xuất hiện ở mỗi giếng tương ứng với lượng kháng thể đặc hiệu đối với virus Gumboro của gà hiện diện trong mẫu được pha loãng.
Thành phần bộ kit :
- 1. 2 đĩa 96 giếng, các giếng có phủ sẵn kháng nguyên IBD.
- 2. Mẫu đối chứng dương với kháng thể kháng IBDV trong dung dịch đệm phosphate có protein ổn định và ProClin 0.063% (500µl) (ProClin là một chất kháng các vi sinh vật và không ngăn cản việc gắn kết kháng thể)
- 3. Mẫu đối chứng âm là huyết thanh gà sạch bệnh trong dung dịch đệm phosphate cũng có protein ổn định và ProClin 0.063% (500µl).
- 4. Kháng thể thứ cấp kháng kháng thể của gà thu nhận từ lừa được đánh dấu bằng enzyme alkaline phosphastase trong dung dịch đệm Tris với 1 thuốc nhuộm trơ có màu xanh và Sodium Azide (NaN3) 0.1% (11ml).
- 5. Cơ chất tạo màu phản ứng bao gồm phenolphthalein monophosphate và coenzyme trong dung dịch đệm diethanolamine (11ml).
- 6. Dung dịch dừng phản ứng là NaOH trong dung dịch đệm diethanolamine (11ml).
- 7. Dung dịch đệm rửa: đệm phosphate với ProClin 0.63% (50ml) vừa đủ để pha được 1000ml dung dịch rửa.
- 8. Dung dịch pha loãng mẫu: đệm phosphate, protein ổn định và Proclin 0.63% (50ml) vừa đủ để pha được 500 ml dung dịch pha loãng.
3.6.3.3. Các bước phản ứng ELISA gián tiếp
- Để thuốc thử ở nhiệt độ phòng và đã trộn đều chúng bằng máy lắc
- Ghi chép mẫu và các vị trị đối chứng trên 1 tờ giấy tạm 12*8. Các đối chứng âm và đối chứng dương phải tiến hành chạy 2 lần.
1. Nhỏ 50 µl đối chứng và 50 µl dung dịch mẫu đã pha loãng ở tỷ lệ 1/500 vào các giếng theo đúng sơ đồ đĩa ELISA.
2. Đậy vỉ bằng bìa dính và ủ 30 phút ở +37oC.
3. Lấy bìa dính ra và rửa vỉ 3 lần với dung dịch rửa đã pha loãng (300 µl cho 1 giếng). Xoay ngược và làm khô kĩ lưỡng trên giấy thấm.
4. Thêm 50 µl dung dịch conjugate (lọ số 2) vào mỗi giếng 5. Đậy vỉ bằng bìa dính và ủ 30 phút ở +37oC.
6. Lấy bìa dính ra và rửa vỉ 3 lần với dung dịch rửa đã pha loãng (300 µl cho 1 giếng). Làm khô như hướng dẫn trên.
7. Thêm 50 µl dung dịch ABTS vào mỗi giếng. Lắc đều vỉ trong 2 giây. 8. Đậy vỉ bằng bìa dính và thúc đẩy phản ứng tạo mầu trong vòng 30 phút ở
+37oC ở nơi tối.
9. Lấy bìa dính ra và thêm 50 µl dung dịch dừng phản ứng vào mỗi giếng. Trộn đều bằng cách lắc nhẹ mặt vỉ.
10. Đọc kết quả ở bước sóng 405 nm.
* Phản ứng dương tính: Có xuất hiện màu. So màu trong quang phổ kế ở bước sóng 405 nm để định lượng mức độ phản ứng.
- S/P ≥ 0,2: Positive (+) hay huyết thanh đối chứng dương - S/P ≤ 0,2: Positive (-) hay huyết thanh đối chứng âm * Phản ứng âm tính: Không xuất hiện màu
Tiêu chuẩn: Titer > 396 đạt ngưỡng bảo hộ, Titer ≤ 396 Âm tính