2.2.1. Quan điểm và cách tiếp cận trong nghiên cứu
- Ngành nấm nói chung, các loài nấm ĐTHT nói riêng rất đa dạng và phong phú, vì vậy đề tài lấy quan điểm lịch sử và thực tiễn áp dụng trong nghiên cứu. Việc kế thừa các tài liệu nghiên cứu đã được công bố có một tầm quan trọng đặc biệt, để tiết kiệm và tránh sự chồng chéo trong nghiên cứu.
- Căn cứ vào mục tiêu đặt ra, thông qua nghiên cứu về đặc điểm sinh học, sinh thái và giá trị sử dụng của các loài nấm ĐTHT trong khu vực, làm cơ sở cho việc đưa ra những giải pháp quản lý, khai thác. Chú trọng đến việc đề ra hướng bảo vệ, sử dụng và khai thác một số loài nấm quí. Nhưng vẫn đảm bảo giá trị đa dạng sinh học, quản lý bảo vệ được nguồn tài nguyên thiên nhiên hiện có mà vẫn đáp ứng được nhu cầu của người dân địa phương trong sự phát triển theo hướng có lợi. Đặt vấn đề ưu tiên sử dụng bền vững nguồn dược liệu quí trong khu vực nghiên cứu là nguyên tắc quan trọng khi đưa ra các giải pháp quản lý.
- Đa dạng các loài nấm ĐTHT là sự thích ứng giữa các loài nấm với điều kiện ngoại cảnh, đa dạng côn trùng và tác động của con người. Vì vậy nghiên cứu phải dựa vào sinh cảnh hiện có, các đặc điểm sinh vật học của loài và những thay đổi về sinh thái môi trường để xem xét.
2.2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu chung
Đề tài áp dụng phương pháp kế thừa về số liệu, phương pháp điều tra, các nghiên cứu đặc điểm sinh thái học của nấm ĐTHT; giám định và phân lập nấm trong phòng thí nghiệm; tổng hợp, sử lý số liệu, vẽ biểu đồ trên phần mềm Exel.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
2.2.3. Công tác chuẩn bị
- Thu thập số liệu chung về vị trí địa lý, điều kiện tự nhiên, kinh tế - xã hội các xã nằm trong phạm vi khu vực nghiên cứu ; các tài liệu , báo cáo, các nghiên cứu khoa học .... về Khu BTTN Tây Yên Tử ; các tài liệu về nấm ĐTHT và những vấn đề có liên quan đến lĩnh vực nghiên cứu .
- Chuẩn bị bản đồ, máy ảnh , máy định vị và các dụng cụ phục vụ cho điều tra và thu hái nấm.
- Nắm và phân loại các trạng thái , loại hình rừng hiện có trong khu vực nghiên cứu.
- Xác định hệ thống tuyến, địa điểm điều tra , trên cơ sở các tài liệu về đặc điểm sinh vật học, sinh thái học của nấm như: mùa vụ sinh trưởng ; vị trí nấm th ường mọc, độ cao, độ ẩm, độ tàn che…
2.2.4. Các phƣơng pháp nghiên cứu cụ thể
2.2.4.1. Điều tra thu mẫu và giám định nấm ĐTHT tại Khu BTTN Tây Yên Tử, Sơn Động, Bắc Giang
- Điều tra ngoại nghiệp: Điều tra được tiến hành định kỳ vào các tháng từ 4 -9, tập trung vào các tháng mùa mưa. Khảo sát thu mẫu được thực hiện trên các tuyến điều tra ngoài thực địa qua các dạng địa hình , các dạng thực bì trong khu vực nghiên cứu . Các tuyến điều tra được thiết kế đi men theo rìa suối , dọc theo khe, suối cạn và đườn g mòn hoặc theo dông núi từ dưới thấp lên cao và ngược lại. Trên tuyến điều tra cứ 20m - 30m tiến hành 1 điểm điều tra , hoặc phát hiện địa điểm có điều kiện thuận lợi cho nấm ĐTHT phát triển thì tiến hành khoanh vùng và điều tra tỷ mỷ. Tại các điểm điều tra tiến hành điều tra kỹ phía dưới thân cây đổ, dưới lớp lá mục và các khoảng đất trống trong rừng . Phát hiện được mẫu nấm tiến hành đào thu mẫu nấm kể cả côn trùng bị ký sinh còn dính ; đánh số hiệu, chụp ảnh, đo đếm kích thước , mô tả đặc điểm hình thái của nấm , côn trùng bị ký sinh và các đặc điểm của địa điểm thu mẫu… . Các thông tin được ghi vào biểu sau:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Biểu ghi chép mẫu nấm thu hái ngoài tự nhiên
Người thu hái:...
Ngày thu hái:...Nơi hái:...
Điểm điều tra số………
Địa hình (độ cao, hướng phơi, độ dốc):....
Tuyến điều tra số:……….
Sinh cảnh địa điểm: Loại rừng, loài cây chính, ven đường, khe suối....
TT Tên nấm thu hái
Số hiệu
Đặc điểm hình thái Sinh thái
Côn trùng bị ký sinh Thân nấm Kích thước, mầu sắc thể quả Giá thể mọc (trên đất, trên cây…) Hình thái mọc (mọc cụm, đám, rải rác, mọc tán xạ) Hình dạng Kích thước
Mẫu nấm sau khi thu hái , được bọc trong giấy khô, mềm, tránh không làm tổn thương đến nấm và đưa về phòng thí nghiệm để giám định , nghiên cứu đặc điểm giải phẫu, bào tử và phân lập thuần khiết nấm.
- Mô tả và giám định mẫu nấm thu hái: Giám định mẫu dựa trên đặc điểm hình thái, giải phẫu, đối chiếu, so sánh với chuyên khảo về Cordyceps của Gi-Ho Sung et al. (2007), Sung Jae Mo (2000), Mao X.L.(2000) và Tsuguo Hongo và Masana Izawa (1994). Một số loài quan trọng việc giám định có thể được thực hiện bằng phương pháp sinh học phân tử, dựa trên phân đoạn 18S ARN ribosom.
2.2.4.2. Đánh giá đa dạng sinh học các loài nấm ĐTHT tại Khu BTTN Tây Yên Tử
- Đa dạng về thành phần loài, tần suất xuất hiện: Các loài nấm thu được trong khu vực điều tra được phân tích đánh giá theo % số loài thuộc các chi nấm. Tần suất xuất hiện của loài nấm Đông trùng hạ thảo được chia làm 3 cấp: rất phổ biến (ký hiệu +++), khá phổ biến (ký hiệu ++) và ít phổ biến (ký hiệu +), được tính toán thông qua độ bắt gặp. Độ bắt gặp (Pi) được xác định bằng tỷ lệ % của loài nấm Đông trùng hạ thảo đó xuất hiện, theo công thức tính như sau: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn .100 M N Pi ; Trong đó: Pi = Độ bắt gặp loài i;
N = Số lượng mẫu của loài nấm đông trùng hạ thảo i cần tính; M = Tổng số lượng mẫu nấm thu được ;
Căn cứ vào giá trị của Pi để phân thành 3 cấp độ bắt gặp như sau: + Loài ít phổ biến: Pi < 10% ký hiệu là + + Loài khá phổ biến: 10% Pi 30% ký hiệu là ++ + Loài rất phổ biến: Pi > 30% ký hiệu là +++
Từ số liệu thu được, lập bảng biểu thống kê và vẽ các biểu đồ minh hoạ kết quả nghiên cứu.
- Đa dạng về phân bố: Phân bố của các loài nấm được thống kê theo đai độ cao, loại hình rừng, độ tàn che và thời gian phát sinh trong năm đối với các loài nấm Đông trùng hạ thảo.
- Đa dạng về ký chủ: Do côn trùng bị nấm ký sinh có thể ở giai đoạn sâu non, nhộng và sâu trưởng thành và thường bị biến dạng về hình thái nên việc giám định thường gặp nhiều khó khăn. Căn cứ vào đặc điểm hình thái của các loài côn trùng bị nấm ký sinh, đối chiếu với các chuyên khảo về các loài côn trùng thuộc bộ Cánh vảy (Lepidoptera), bộ Cánh cứng (Coleoptera), Bộ cánh đều (Homoptera), bộ cánh Thẳng (Orthoptera) và Bộ Cánh không đều (Hemiptera)…. Xác định côn trùng bị ký sinh đến bộ (order), trong trường hợp mẫu còn nguyên vẹn có thể xác định đến giống (genus) hoặc đến loài (species).
- Đa dạng về giá trị dƣợc liệu: Giá trị sử dụng và giá trị dược liệu của nấm trên cơ sở tổng quan tài liệu của các tác giả Mao X.L., 2000 ….
2.2.4.3. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của loài nấm Isaria tenuipes - Trang thiết bị, vật tƣ để nghiên cƣ́u :
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
+ Dụng cụ để phân lập: Đèn cồn, que cấy nấm, hộp petri, ống nghiệm, bông, băng cuốn hộp Petri, dao, bút ghi thủy tinh…
+ Máy móc để nghiên cứu : Tủ cấy nấm, tủ định ôn, tủ lạnh, tủ sấy, bếp điện, nồi hấp, máy ảnh, kính hiển vi….
- Phân lập thuần khiết nấm: Phân lập thuần khiết nấm từ thể quả thu được trên môi trường phân lập nấm ĐTHT là môi trường PDA (Potato Dextrose Agar). Môi trường sau khi pha xong được hấp khử trùng ở 121oC trong thời gian 20 phút sau đó được đổ vào các hộp lồng vô trùng. Chọn mô nấm tươi mới, non không bị sâu bệnh. Dùng cồn 70% rửa bề mặt nấm, tách lấy mô nấm bên trong thể quả cấy vào môi trường dinh dưỡng; sau khi cấy xong cất giữ mẫu trong tủ định ôn ở nhiệt độ 25oC. Chọn sợi nấm không bị tạp nhiễm mọc ra từ mô nấm cấy truyền sang môi trường dinh dưỡng mới. Sau khi tách sợi nấm khoảng 2- 3 lần, sợi nấm không bị nhiễm khuẩn, nấm tạp, và sợi nấm mọc đồng nhất thì ta được sợi nấm thuần khiết.
- Nghiên cứu ảnh hƣởng của nhiệt độ không khí đến sự sinh trƣởng của hệ sợi nấm
Môi trường thí nghiệm là PDA. Môi trường được hấp khử trùng ở nhiệt độ 121°C, áp suất tương đương với 1atm trong 30 phút, Đổ các môi trường vào 5 hộp lồng đã được khử trùng dày 3 -5 mm. Sau ít nhất là 2 giờ thạch khô, cứng rồi cấy vào chính giữa mỗi hộp lồng một điểm giống nấm đúng bằng que cấy, băng hộp lồng lại và để trong tủ định ôn có nhiệt độ khác nhau: 150
C, 200C, 250C, 300C và 350C. Tiến hành theo dõi chụp ảnh, mô tả các đặc điểm của hệ sợi và đo tốc độ sinh trưởng của hệ sợi nấm, tiến hành đo lần đầu tiên sau 5 ngày bắt đầu cấy, tiếp sau đó là đo sau 10 ngày và đo sau 15 ngày. Độ dầy của hệ sợi được đánh giá theo Schwantes năm 1971.
- Nghiên cứu ảnh hƣởng của độ ẩm không khí đến sự sinh trƣởng của hệ sợi nấm
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Thí nghiệm được tiến hành theo phương pháp của Booth C. Tạo độ ẩm không khí khác nhau trong bình kín thông qua nồng độ NaCl, cụ thể là pha NaCl với nồng độ như sau:
NaCl (g/1lít H2O) 0 8 16 24 32 40
RH (%) 100 95 90 85 80 75
Dung dịch pha xong đổ vào bình hút ẩm loại lớn, đậy nắp lại để ở phòng thí nghiệm trong tối có nhiệt độ không khí khoảng 23 - 27°C. Sau 48 giờ trong các bình hút ẩm khác nhau sẽ có độ ẩm không khí khác nhau, phụ thuộc nồng độ NaCl. Khi nồng độ NaCl càng lớn thì tạo độ ẩm khômg khí càng lớn. Môi trường thạch khoai tây sau khi hấp khử trùng, được đổ vào các hộp lồng đã được khử trùng thông qua hấp sấy và đổ một lớp môi trường PDA dày 3- 5 mm. Cấy giống nấm đã được phân lập vào chính giữa hộp lồng với lượng bằng nhau bằng que cấy. Đặt các hộp lồng vào các bình hút ẩm có độ ẩm không khí khác nhau đó với mỗi bình làm 5 hộp lồng. Tiến hành theo dõi chụp ảnh, mô tả các đặc điểm của hệ sợi và đo tốc độ sinh trưởng của hệ sợi nấm, tiến hành đo lần đầu tiên sau 5 ngày bắt đầu cấy, tiếp sau đó là đo sau 10 ngày và đo sau 15 ngày. Độ dầy của hệ sợi được đánh giá theo Schwantes năm 1971.
- Nghiên cứu ảnh hƣởng của pH môi trƣờng đến sự sinh trƣởng của hệ sợi nấm
Phương pháp được tiến hành như sau: môi trường gốc nuôi cấy nấm là PDA. Môi trường gốc có pH = 6, dùng HCl 10% để điều chỉnh mức pH của môi trường là 4,0; 5,0, dùng NaOH để điều chỉnh pH môi trường theo các mức 7,0; 8,0. Sau đó nút miệng bình tam giác bằng bông sạch và quấn giấy báo phía trên. Môi trường được hấp khử trùng ở nhiệt độ 121°C, áp suất tương đương với 1atm trong 30 phút, Đổ các môi trường có các mức pH khác nhau đó vào 5 hộp lồng đã được khử trùng dày 3 -5 mm. Sau ít nhất là 2 giờ thạch khô, cứng rồi cấy vào chính giữa mỗi hộp lồng một điểm giống nấm đúng bằng que cấy, băng hộp lồng lại và để trong tủ định ôn có nhiệt độ 25.0°C ± 1. Tiến hành theo dõi chụp ảnh,
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
mô tả các đặc điểm của hệ sợi và đo tốc độ sinh trưởng của hệ sợi nấm, tiến hành đo lần đầu tiên sau 5 ngày bắt đầu cấy, tiếp sau đó là đo sau 10 ngày và đo sau 15 ngày. Độ dầy của hệ sợi được đánh giá theo Schwantes năm 1971.
- Nghiên cứu ảnh hƣởng của môi trƣờng dinh dƣỡng tới sinh trƣởng của hệ sợi
Thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng ảnh hưởng tới sinh trưởng của hệ sợi trong nuôi cấy thuần khiết được thực hiện với 3 loại môi trường dinh dưỡng khác nhau: môi trường PDA, môi trường PDA bổ sung 10% pepton và môi trường PDA bổ sung 10% bột nhộng tằm. Môi trường được hấp khử trùng ở nhiệt độ 121°C, áp suất tương đương với 1atm trong 30 phút. Đổ các môi trường vào 5 hộp lồng đã được khử trùng dày 3 -5 mm. Sau ít nhất là 2 giờ thạch khô, cứng rồi cấy vào chính giữa mỗi hộp lồng một điểm giống nấm đúng bằng que cấy, băng hộp lồng lại và để trong tủ định ôn có nhiệt độ 25°C ± 1. Tiến hành theo dõi chụp ảnh, mô tả các đặc điểm của hệ sợi và đo tốc độ sinh trưởng của hệ sợi nấm, tiến hành đo lần đầu tiên sau 5 ngày bắt đầu cấy, tiếp sau đó là đo sau 10 ngày và đo sau 15 ngày. Độ dầy của hệ sợi được đánh giá theo Schwantes năm 1971.
2.2.4.4. Đề xuất hƣớng bảo tồn, khai thác, sử dụng và phát triển một số loài nấm quý
Đề xuất hướng bảo tồn, khai thác, sử dụng và phát triển nấm ĐTHT được căn cứ vào kết quả nghiên cứu về đặc điểm phân bố, giá trị dược liệu và đặc điểm sinh học của các loài nấm. Đề xuất trên cơ sở phát triển bền vững và sử dụng hợp lý nguồn tài nguyên rừng.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
CHƢƠNG III
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN