Phương pháp nhuộm hoá mô miễn dịch (IHC) có quy trình tẩm ñúc bằng parafin giống phương pháp làm tiêu bản vi thể.
* Các bước nhuộm:
Bước 1: Làm sạch tiêu bản
Khử parafin, khử xylen, khử cồn giống phương pháp làm tiêu bản vi thể. Sau khi cho chảy dưới vòi nước rửa lại tiêu bản bằng nước cất.
Bước 2: Hoạt hoá enzym
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 31
Bước 3: Khử peroxydase nội sinh
Dùng H2O2 trong dung môi Methanol (1H2O2 30%:9Methanol). Ngâm tiêu bản trong 10 phút.
Bước 4: Gắn kháng thể (KT)
Nhỏ 80 µl KT kháng PRRSV chuẩn/1tiêu bản. ðể tủ ấm 370C/1h hoặc 40C/qua ñêm.
Rửa tiêu bản bằng dung dịch PBS 3 lần (5 phút/lần).
Bước 5: Gắn kháng kháng thể
Nhỏ 2 giọt kháng kháng thể/1 tiêu bản. ðể tủ ấm 370C/1h.
Rửa PBS 3 lần (5phút/lần).
Bước 6: Cho cơ chất
Ngâm tiêu bản trong dung dịch DAB khoảng 3-8 phút. Quan sát kết quả.
Bước 7: Nhuộm nhân tế bào bằng Hematoxylin (30 giây), làm sạch, gắn baume canada và quan sát bằng kính hiển vi quang học.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 32
PHẦN IV
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Nhằm xác ñịnh ñược những biến ñổi bệnh tích ñại thể, vi thể ở lợn bệnh, áp dụng kỹ thuật hoá mô miễn dịch phát hiện sự có mặt của PRRSV trong một số mô của lợn như nội dung nghiên cứu ñã ñặt ra, trong thời gian thực tập chúng tôi ñã tiến hành thu thập ñược nhiều mẫu từ 60 con lợn nghi mắc PRRS tại 3 xã thuộc huyện Phúc Thọ, Hà Nội ở 2 lứa tuổi là lợn con theo mẹ và lợn con sau cai sữạ
Trong quá trình lấy mẫu chúng tôi ñã tuân thủ nghiêm ngặt quy trình theo ñúng quy ñịnh của Cục Thú y như: ñeo khẩu trang, găng tay, mặc áo blue, mổ khám tại các khu vực quy ñịnh riêng và mẫu khi mang về phòng thí nghiệm ñược bảo quản kỹ càng tránh lây lan mầm bệnh. Chúng tôi tiến hành lấy mẫu từ các lợn nghi mắc PRRS, thuộc nhiều giống lợn khác nhaụ Các mẫu thu ñược do chúng tôi trực tiếp mổ khám, lấy mẫu tại ñịa ñiểm mổ của các trại, trên phòng thí nghiệm và một số mẫu do các nhóm nghiên cứu khác gửi về. Chúng tôi tiến hành theo dõi triệu chứng lâm sàng của 60 con lợn thu thập ñược trong thời gian nghiên cứu, mỗi nhóm nghiên cứu chúng tôi quan sát 30 cá thể. Từ kết quả theo dõi triệu chứng lâm sàng chủ yếu, chọn ra 30 con thuộc 2 nhóm có triệu chứng lâm sàng ñiển hình nhất ñể mổ khám và quan sát biến ñổi bệnh lý ñại thể, làm tiêu bản vi thể và nhuộm hoá mô miễn dịch ñể xác ñịnh sự phân bố của virus trong các cơ quan.