* Phương pháp làm tiêu bản vi thể theo quy trình tẩm ựúc bằng parafin, nhuộm Haematoxylin Ờ Eosin (HE).
- Chuẩn bị
+ Dụng cụ và hoá chất: lọ chứa formol 10%, dao, kéo, panh kẹp, cốc ựựng hoá chất, phiến kắnh, máy ựúc block, khuôn ựúc, tủ ấm 370C, máy cắt mảnh microtom, nước ấm 480C, xylen, parafin, thuốc nhuộm Haematoxylin, EosinẦ
+ Lấy bệnh phẩm: bệnh phẩm là ruột, phổi, hạch lâm ba, nãoẦ
- Cố ựịnh bệnh phẩm
Ngâm miếng tổ chức vào dung dịch formol 10% (chú ý bệnh phẩm phải ngập trong formol, thể tắch của formol phải gấp ắt nhất 10 lần thể tắch của bệnh phẩm ựem ngâm). Tuỳ thuộc vào kắch thước và số lượng bệnh phẩm ựem ngâm mà sau từ 10-15 ngày, bệnh phẩm sẽ "chắn" và có thể ựem vùi ựúc bệnh phẩm ựể cắt làm tiêu bản vi thể và hoá miễn dịch.
- Vùi bệnh phẩm
Tiến hành lần lượt các bước sau:
Rửa formol: lấy tổ chức ra khỏi bình formol 10%, cắt thành các miếng có chiều dài, rộng khoảng 4Ờ5mm cho vào khuôn ựúc bằng nhựạ đem rửa dưới vòi nước chảy nhẹ trong 24 giờ ựể rửa sạch formol.
Sau ựó ựưa mẫu vào hệ thống máy chuyển ựúc mẫu tự ựộng trong 18 giờ, lấy mẫu ra và tiến hành ựúc block.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 28
Bảng 3.1. Hệ thống chuyển ựúc mẫu tựựộng
Bình Hóa chất Thời gian (giờ)
1 Cồn 600C 1:00 2 Cồn 600C 1:00 3 Cồn 700C 1:30 4 Cồn 800C 1:30 5 Cồn 960C 1:30 6 Cồn 1000C 1:30 7 Cồn 1000C 1:30 8 Cồn 1000C 1:30 9 Xylen 1:30 10 Xylen 1:30 11 Parafin 2:00 12 Parafin 2:00 - đúc block:
+ Mục ựắch: ựể vùi miếng tổ chức trong môi trường parafin thuần nhất tạo thành một thể thống nhất.
+ Chuẩn bị: máy ựúc block, máy làm lạnh block, parafin. + Phương pháp tiến hành:
đặt miếng bệnh phẩm nằm theo ý muốn vào chắnh giữa khuôn block, sau ựó ựổ nhanh parafin lỏng vào block.
đặt khuôn ựã ựúc sang bàn lạnh của máy làm nguội block. để nguội từ từ ựến khi ựông cứng, ựặc chắc là ựược (nhiệt ựộ của máy làm nguội block thắch hợp 40C, không nên cho nhiệt ựộ thấp hơn vì sẽ làm cho parafin giòn sẽ khó cắt).
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 29 + Chuẩn bị: máy cắt, dao cắt, nước ấm 480C, phiến kắnh, panh kẹp... + Cắt mảnh: cắt bằng máy microtom với ựộ mảnh cắt khoảng 3-5ộm, sao cho mảnh cắt không rách nát phần tổ chức.
+ Tãi mảnh: sau khi cắt ựược, dùng panh kẹp mảnh cắt ựặt vào nước lạnh sau ựó dùng phiến kắnh trong, sáng, không xước hớt mảnh cắt cho sang nước ấm 480C rồi lấy kắnh vớt mảnh cắt sao cho vị trắ mảnh cắt ở 1/3 phiến kắnh. Sau ựó ựể tủ ấm 370C khoảng 2 ngày khi bệnh phẩm khô là có thể ựem nhuộm ựược.
* Nhuộm tiêu bản: Các bước:
+ Khử parafin: cho tiêu bản qua hệ thống xylen gồm 3 lọ: Xylen I: 6h
Xylen II: 6h Xylen III: 12h
+ Khử xylen: cho tiêu bản qua hệ thống cồn gồm 4 lọ: Cồn 1000: 2lần (mỗi lần 1 phút)
Cồn 950: 1 lần Cồn 700: 1 lần Cồn 500: 1 lần
+ Khử cồn: cho dưới vòi nước chảy 15 phút. + Nhuộm Haematoxylin (nhuộm nhân)
Khi nhấc tiêu bản ra khỏi nước lau khô xung quanh tiêu bản, nhỏ haematoxylin ngập tiêu bản. để trong khoảng hơn 5 phút sau ựó ựổ thuốc nhuộm ựi, rửa qua nước. đem lau sạch nước xung quanh tiêu bản và vẩy khô ựị Kiểm tra màu sắc, nếu thấy tiêu bản xanh tắm là ựược.
Nếu nhạt màu thì nhúng tiêu bản qua NaHCO3 1% (30 giây). Nếu ựậm quá thì nhúng tiêu bản vào lọ cồn axit (cồn 960 + HCl 1%) trong 30 giâỵ
Sau khi ựiều chỉnh màu ta rửa sạch tiêu bản bằng nước cất. Sau ựó cho tiêu bản qua hệ thống cồn:
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 30 Cồn 500: 1 lần
Cồn 700: 1 lần Cồn 950: 1 lần Cồn 1000: 2 lần Rửa tiêu bản bằng nước cất. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Nhuộm Eosin (nhuộm bào tương)
Nhỏ Eosin ngập tiêu bản khoảng 5-10 phút tuỳ theo thực tế màu Eosin. Sau ựó rửa nước chảy 15 phút cho hết Eosin thừa bám trên phiến kắnh.
Cho tiêu bản qua hai lọ cồn 1000 mỗi lọ 1 phút.
+ Tẩy cồn, làm trong tiêu bản: cho tiêu bản ựi qua hai lọ xylen mỗi lọ 3 phút.
- Gắn Baume canada:
Nhỏ một giọt Baume canada lên lamen rồi gắn nhanh lên tiêu bản khi vẫn còn xylen trên tiêu bản. Ấn nhẹ ựể dồn hết bọt khắ ra ngoàị
- đánh giá kết quả:
đem soi lên kắnh hiển vi quang học vật kắnh 10. Nếu thấy nhân bắt màu xanh tắm, bào tương bắt màu hồng tươi, tiêu bản trong sáng, không có nước, không có bọt khắ là ựược.