Hoá mô miễn dịch là một xét nghiệm kỹ thuật cao, sử dụng các kháng thể ựã biết ựể phát hiện các kháng nguyên ựặc hiệu tương ứng có trong tế bào và mô. Nếu có kháng nguyên ựặc hiệu sẽ xảy ra phản ứng tạo phức hợp kháng nguyên - kháng thể, có thể phát hiện ựược bằng kắnh hiển vị
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 22 IHC là sự kết hợp giữa hai ngành mô bệnh học (Histopathology) và miễn dịch học (Immunology). Kỹ thuật hoá mô miễn dịch ựược dùng không những chỉ ựể xác ựịnh một mô có hoặc không có kháng nguyên ựặc hiệu, mà còn ựể xác ựịnh tình trạng kháng nguyên của những tế bào ựặc hiệu trong mô và vị trắ của kháng nguyên trong tế bàọ Nhờ ựó có thể xác ựịnh dòng tế bào, xác ựịnh rõ tắnh chất sinh học của quần thể tế bào trong cùng một dòng, và chức năng khác nhau của các loại tế bào, thậm chắ còn có thể xác ựịnh các tác nhân gây bệnh như vi khuẩn và virus nữạ Chìa khoá chắnh trong hoá mô miễn dịch là phản ứng ựặc hiệu của kháng thể với kháng nguyên. Mặc dù ựược áp dụng rộng rãi với nhiều nguyên lý khác nhau trong nhiều lĩnh vực khác nhau, nhưng trong giải phẫu bệnh ngoại khoa, hoá mô miễn dịch có tác dụng rất lớn và sâu sắc trong việc chẩn ựoán giải phẫu bệnh.
Giải phẫu bệnh ngoại khoa vốn là một ngành có tắnh chất chủ quan cố hữụ Mặc dù ựã có nhiều tiêu chuẩn mô bệnh học "cơ bản" dùng cho chẩn ựoán, song trong thực tế, sự trùng lặp và giống nhau của các thương tổn, cũng như có nhiều thương tổn không ựiển hình làm cho việc chẩn ựoán mô bệnh học gặp nhiều khó khăn, khó ựi ựến chẩn ựoán xác ựịnh hoặc khó thống nhất giữa các nhà giải phẫu bệnh với nhaụ Vì thế ựã từ lâu các nhà giải phẫu bệnh trên thế giới ựã tìm nhiều phương pháp giúp chẩn ựoán phân biệt như mô hoá học (histochemistry), mô-enzym học (histoenzymology), miễn dịch huỳnh quang (immunofluorescence), hoá mô miễn dịch, lai tại chỗ (hybridization in stitu)... Hoá mô miễn dịch là một kỹ thuật hiện ựại, mới ựược áp dụng tương ựối rộng rãi ở những nước tiên tiến vì có ựộ chắnh xác cao, nhưng có nhược ựiểm là khá ựắt tiền nên các nước nghèo khó có ựiều kiện áp dụng.
Hóa mô miễn dịch là kết hợp phản ứng miễn dịch và hoá chất ựể làm hiện rõ các kháng nguyên hiện diện trong mô (bào tương, màng tế bào, nhân). Vì kháng nguyên không thể quan sát hình thái ựược nên người ta phải xác ựịnh
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 23 vị trắ của nó trên tế bào bằng các phản ứng miễn dịch và hóa học. Có hai kỹ thuật: miễn dịch huỳnh quang và miễn dịch men.
* Nguyên lý của phản ứng:
Cho kháng thể ựặc hiệu lên mô, nếu trong mô có kháng nguyên sẽ có phản ứng kết hợp kháng nguyên-kháng thể. Có hai cách ựể quan sát ựược phức hợp này:
+ Miễn dịch huỳnh quang: cho gắn với một chất phát huỳnh quang và quan sát dưới kắnh hiển vi huỳnh quang.
+ Miễn dịch men: cho gắn với một loại men (peroxidase hoặc alkaline phosphatase) và gắn với chất màu (chromogen), có thể quan sát dưới kắnh hiển vi quang học.
* Hệ thống nhận biết:
Vì phức hợp kháng nguyên-kháng thể không thể phát hiện ựược dưới kắnh hiển vi quang học nên cần một hệ thống ựể hiển thị vị trắ có phản ứng kháng nguyên-kháng thể. Hệ thống này gồm 2 phần: (1) kháng thể thứ hai hay kháng thể bắt màu và (2) hệ thống phóng ựại dấu hiệu nhận biết.
Kháng thể thứ hai là cầu nối kháng thể thứ nhất với hệ thống phóng ựại dấu hiệu nhận biết, ựó là kháng thể chống globulin miễn dịch (Ig) của kháng thể thứ nhất. Thắ dụ nếu kháng thể thứ nhất là IgG của chuột, thì kháng thể thứ hai là của thỏ hay dê chống IgG chuột). Trong phức hợp Avidin-Biotin và phương pháp Streptavidin kháng thể thứ hai ựược gắn biotin. Hệ thống phóng ựại dấu hiệu nhận biết gồm một men (enzyme), chất nền (subtrate) và chất màu (chromogen). Men phải ựược gắn với kháng thể thứ hai bằng một phản ứng kháng nguyên-kháng thể hay bằng cầu nối hóa học (avidin và biotin). Cần thêm vào một chất nền thắch hợp với men và cuối cùng là chất màu ựược
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 24 gắn lên ựể có thể thấy ựược sản phẩm, cho phép xác ựịnh sự hiện diện của kháng nguyên trong mô dưới kắnh hiển vi quang học (Yunus M.).
2.3.3. Ứng dụng của hoá mô miễn dịch trong chẩn ựoán giải phẫu bệnh
Hoá mô miễn dịch ựã ựược ứng dụng ựể chẩn ựoán rất nhiều bệnh truyền nhiễm như: dịch tả lợn, Newcastle,Ầ và mới ựây là Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản. Phản ứng dùng ựể phát hiện sự có mặt của kháng nguyên trong mẫu mô ựể chẩn ựoán bệnh dựa trên nguyên lý: sự kết hợp giữa kháng nguyên là PRRSV với kháng thể PRRS chuẩn ựược nhận biết bởi chất phát màu là DAB (3,3 Diamino benzidine tetrahydrochloride), cho phép ta phát hiện chắnh xác vị trắ cư trú của virus, ựiều này rất có ý nghĩa trong nghiên cứu bệnh.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 25
PHẦN III
đỐI TƯỢNG - NỘI DUNG - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. đỐI TƯỢNG
Nghiên cứu ựược tiến hành với ựối tượng là lợn nghi mắc PRRS ở huyện Phúc Thọ, thành phố Hà Nội bao gồm:
- Lợn con theo mẹ - Lợn sau cai sữa
3.2. NỘI DUNG
Nhằm thực hiện ựược mục tiêu của ựề tài, chúng tôi ựã tiến hành nghiên cứu các nội dung sau:
- Nghiên cứu một số biểu hiện triệu chứng lâm sàng chủ yếu của lợn mắc PRRS.
- Nghiên cứu biến ựổi bệnh lý ựại thể chủ yếu ở một số cơ quan của lợn mắc PRRS.
- Nghiên cứu biến ựổi bệnh lý vi thể chủ yếu ở một số cơ quan của lợn mắc PRRS
- Chẩn ựoán virus PRRS bằng phương pháp hoá mô miễn dịch.
3.3. NGUYÊN LIỆU 3.3.1. Nguyên liệu
- Lợn ở 2 nhóm tuổi: lợn con theo mẹ, lợn sau cai sữa mắc Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản.
- Các bệnh phẩm của lợn mắc Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản bao gồm: phổi, hạch phổi, tim, gan, ruột, thận, nãọ..
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 26 để thực hiện các nội dung nghiên cứu, chúng tôi sử dụng các dụng cụ và hoá chất như sau: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
* Dụng cụ: tủ lạnh, tủ sấy, tủ ấm 370C, tủ ấm 560C, máy ựúc block, máy cắt microtom, kắnh hiển vi quang học, ựũa thuỷ tinh, ống nghiệm, lam kắnh, lamen, dao, bộ cốc, lọ ựựng hoá chất và một số dụng cụ khác có liên quan.
* Hoá chất:
- Nước cất, cồn Etylic, cồn Methylic, axit Clohydric, parafin, xylen, focmol 10%, dung dịch ựệm PBS (photphat buffer salin), hoá chất phát màu DAB (3,3 Diamino benzidine tetrahydrochloride), H2O2 (hydro peroxyt)Ầ
- Thuốc nhuộm: Eosin, Haematoxylin. + Eosin: nhuộm bào tương tế bàọ + Haematoxylin: nhuộm nhân tế bàọ
- Kháng thể kháng PRRSV chuẩn, kháng kháng thể tương ứng chẩn ựoán PRRS.
- Muối NaHCO3 (natri bicacbonat)... và các hoá chất khác.
3.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.4.1. Phương pháp quan sát, thống kê
để xác ựịnh ựược triệu chứng lâm sàng chủ yếu của lợn mắc PRRS, chúng tôi tiến hành quan sát, ghi chép, thống kê các biểu hiện của lợn từ khi xuất hiện những dấu hiệu bệnh lý ựầu tiên. đồng thời dựa vào các ựặc ựiểm dịch tễ học, những can thiệp trong quá trình bệnh xảy ra cũng như thu thập các thông tin liên quan. Tiến hành phân tắch, thống kê ựể ựưa ra những kết quả chắnh xác. Xác ựịnh chắnh xác những triệu chứng lâm sàng chủ yếu có ý nghĩa vô cùng quan trọng cho các bước thắ nghiệm tiếp theọ
3.4.2.Phương pháp mổ khám
để xác ựịnh ựược các biến ựổi ựại thể của các cơ quan, tổ chức của lợn mắc PRRS cần tiến hành mổ khám những lợn có biểu hiện triệu chứng lâm
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 27 sàng của lợn mắc hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản PRRS . Lợn bệnh ựược cố ựịnh cẩn thận, tiến hành lấy máu từ vịnh tĩnh mạch cổ. Lột da và bộc lộ xoang ngực, xoang bụng, tách các cơ quan nội tạng khỏi cơ thể quan sát và chụp ảnh. Tiến hành thu mẫu các cơ quan như: phổi, hạch phổi, tim, gan, lá láchẦ. ngâm trong formol 10% làm tiêu bản vi thể..
3.4.3. Phương pháp làm tiêu bản vi thể
* Phương pháp làm tiêu bản vi thể theo quy trình tẩm ựúc bằng parafin, nhuộm Haematoxylin Ờ Eosin (HE).
- Chuẩn bị
+ Dụng cụ và hoá chất: lọ chứa formol 10%, dao, kéo, panh kẹp, cốc ựựng hoá chất, phiến kắnh, máy ựúc block, khuôn ựúc, tủ ấm 370C, máy cắt mảnh microtom, nước ấm 480C, xylen, parafin, thuốc nhuộm Haematoxylin, EosinẦ
+ Lấy bệnh phẩm: bệnh phẩm là ruột, phổi, hạch lâm ba, nãoẦ
- Cố ựịnh bệnh phẩm
Ngâm miếng tổ chức vào dung dịch formol 10% (chú ý bệnh phẩm phải ngập trong formol, thể tắch của formol phải gấp ắt nhất 10 lần thể tắch của bệnh phẩm ựem ngâm). Tuỳ thuộc vào kắch thước và số lượng bệnh phẩm ựem ngâm mà sau từ 10-15 ngày, bệnh phẩm sẽ "chắn" và có thể ựem vùi ựúc bệnh phẩm ựể cắt làm tiêu bản vi thể và hoá miễn dịch.
- Vùi bệnh phẩm
Tiến hành lần lượt các bước sau:
Rửa formol: lấy tổ chức ra khỏi bình formol 10%, cắt thành các miếng có chiều dài, rộng khoảng 4Ờ5mm cho vào khuôn ựúc bằng nhựạ đem rửa dưới vòi nước chảy nhẹ trong 24 giờ ựể rửa sạch formol.
Sau ựó ựưa mẫu vào hệ thống máy chuyển ựúc mẫu tự ựộng trong 18 giờ, lấy mẫu ra và tiến hành ựúc block.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 28
Bảng 3.1. Hệ thống chuyển ựúc mẫu tựựộng
Bình Hóa chất Thời gian (giờ)
1 Cồn 600C 1:00 2 Cồn 600C 1:00 3 Cồn 700C 1:30 4 Cồn 800C 1:30 5 Cồn 960C 1:30 6 Cồn 1000C 1:30 7 Cồn 1000C 1:30 8 Cồn 1000C 1:30 9 Xylen 1:30 10 Xylen 1:30 11 Parafin 2:00 12 Parafin 2:00 - đúc block:
+ Mục ựắch: ựể vùi miếng tổ chức trong môi trường parafin thuần nhất tạo thành một thể thống nhất.
+ Chuẩn bị: máy ựúc block, máy làm lạnh block, parafin. + Phương pháp tiến hành:
đặt miếng bệnh phẩm nằm theo ý muốn vào chắnh giữa khuôn block, sau ựó ựổ nhanh parafin lỏng vào block.
đặt khuôn ựã ựúc sang bàn lạnh của máy làm nguội block. để nguội từ từ ựến khi ựông cứng, ựặc chắc là ựược (nhiệt ựộ của máy làm nguội block thắch hợp 40C, không nên cho nhiệt ựộ thấp hơn vì sẽ làm cho parafin giòn sẽ khó cắt). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 29 + Chuẩn bị: máy cắt, dao cắt, nước ấm 480C, phiến kắnh, panh kẹp... + Cắt mảnh: cắt bằng máy microtom với ựộ mảnh cắt khoảng 3-5ộm, sao cho mảnh cắt không rách nát phần tổ chức.
+ Tãi mảnh: sau khi cắt ựược, dùng panh kẹp mảnh cắt ựặt vào nước lạnh sau ựó dùng phiến kắnh trong, sáng, không xước hớt mảnh cắt cho sang nước ấm 480C rồi lấy kắnh vớt mảnh cắt sao cho vị trắ mảnh cắt ở 1/3 phiến kắnh. Sau ựó ựể tủ ấm 370C khoảng 2 ngày khi bệnh phẩm khô là có thể ựem nhuộm ựược.
* Nhuộm tiêu bản: Các bước:
+ Khử parafin: cho tiêu bản qua hệ thống xylen gồm 3 lọ: Xylen I: 6h
Xylen II: 6h Xylen III: 12h
+ Khử xylen: cho tiêu bản qua hệ thống cồn gồm 4 lọ: Cồn 1000: 2lần (mỗi lần 1 phút)
Cồn 950: 1 lần Cồn 700: 1 lần Cồn 500: 1 lần
+ Khử cồn: cho dưới vòi nước chảy 15 phút. + Nhuộm Haematoxylin (nhuộm nhân)
Khi nhấc tiêu bản ra khỏi nước lau khô xung quanh tiêu bản, nhỏ haematoxylin ngập tiêu bản. để trong khoảng hơn 5 phút sau ựó ựổ thuốc nhuộm ựi, rửa qua nước. đem lau sạch nước xung quanh tiêu bản và vẩy khô ựị Kiểm tra màu sắc, nếu thấy tiêu bản xanh tắm là ựược.
Nếu nhạt màu thì nhúng tiêu bản qua NaHCO3 1% (30 giây). Nếu ựậm quá thì nhúng tiêu bản vào lọ cồn axit (cồn 960 + HCl 1%) trong 30 giâỵ
Sau khi ựiều chỉnh màu ta rửa sạch tiêu bản bằng nước cất. Sau ựó cho tiêu bản qua hệ thống cồn:
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 30 Cồn 500: 1 lần
Cồn 700: 1 lần Cồn 950: 1 lần Cồn 1000: 2 lần Rửa tiêu bản bằng nước cất.
+ Nhuộm Eosin (nhuộm bào tương)
Nhỏ Eosin ngập tiêu bản khoảng 5-10 phút tuỳ theo thực tế màu Eosin. Sau ựó rửa nước chảy 15 phút cho hết Eosin thừa bám trên phiến kắnh.
Cho tiêu bản qua hai lọ cồn 1000 mỗi lọ 1 phút.
+ Tẩy cồn, làm trong tiêu bản: cho tiêu bản ựi qua hai lọ xylen mỗi lọ 3 phút.
- Gắn Baume canada:
Nhỏ một giọt Baume canada lên lamen rồi gắn nhanh lên tiêu bản khi vẫn còn xylen trên tiêu bản. Ấn nhẹ ựể dồn hết bọt khắ ra ngoàị
- đánh giá kết quả:
đem soi lên kắnh hiển vi quang học vật kắnh 10. Nếu thấy nhân bắt màu xanh tắm, bào tương bắt màu hồng tươi, tiêu bản trong sáng, không có nước, không có bọt khắ là ựược.
3.4.4. Phương pháp nhuộm hoá mô miễn dịch (Immunohistochemistry-IHC)
Phương pháp nhuộm hoá mô miễn dịch (IHC) có quy trình tẩm ựúc bằng parafin giống phương pháp làm tiêu bản vi thể.
* Các bước nhuộm:
Bước 1: Làm sạch tiêu bản
Khử parafin, khử xylen, khử cồn giống phương pháp làm tiêu bản vi thể. Sau khi cho chảy dưới vòi nước rửa lại tiêu bản bằng nước cất.
Bước 2: Hoạt hoá enzym
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 31
Bước 3: Khử peroxydase nội sinh
Dùng H2O2 trong dung môi Methanol (1H2O2 30%:9Methanol). Ngâm tiêu bản trong 10 phút. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bước 4: Gắn kháng thể (KT)
Nhỏ 80 ộl KT kháng PRRSV chuẩn/1tiêu bản. để tủ ấm 370C/1h hoặc 40C/qua ựêm.
Rửa tiêu bản bằng dung dịch PBS 3 lần (5 phút/lần).
Bước 5: Gắn kháng kháng thể
Nhỏ 2 giọt kháng kháng thể/1 tiêu bản. để tủ ấm 370C/1h.
Rửa PBS 3 lần (5phút/lần).
Bước 6: Cho cơ chất
Ngâm tiêu bản trong dung dịch DAB khoảng 3-8 phút. Quan sát kết quả.
Bước 7: Nhuộm nhân tế bào bằng Hematoxylin (30 giây), làm sạch, gắn baume canada và quan sát bằng kắnh hiển vi quang học.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 32
PHẦN IV
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Nhằm xác ựịnh ựược những biến ựổi bệnh tắch ựại thể, vi thể ở lợn bệnh, áp dụng kỹ thuật hoá mô miễn dịch phát hiện sự có mặt của PRRSV trong một số mô của lợn như nội dung nghiên cứu ựã ựặt ra, trong thời gian thực tập chúng tôi ựã tiến hành thu thập ựược nhiều mẫu từ 60 con lợn nghi mắc PRRS tại 3 xã thuộc huyện Phúc Thọ, Hà Nội ở 2 lứa tuổi là lợn con theo mẹ và lợn con sau cai sữạ
Trong quá trình lấy mẫu chúng tôi ựã tuân thủ nghiêm ngặt quy trình theo ựúng quy ựịnh của Cục Thú y như: ựeo khẩu trang, găng tay, mặc áo blue, mổ khám tại các khu vực quy ựịnh riêng và mẫu khi mang về phòng thắ nghiệm ựược bảo quản kỹ càng tránh lây lan mầm bệnh. Chúng tôi tiến hành lấy mẫu từ các lợn nghi mắc PRRS, thuộc nhiều giống lợn khác nhaụ Các mẫu thu ựược do chúng tôi trực tiếp mổ khám, lấy mẫu tại ựịa ựiểm mổ của các trại, trên phòng thắ nghiệm và một số mẫu do các nhóm nghiên cứu khác gửi về. Chúng tôi tiến hành theo dõi triệu chứng lâm sàng của 60 con lợn thu