trong môi trường biệt hóa (a), trong khi tế bào vẫn duy trì 1 lớp ở môi trường tăng trưởng cho tế bào gốc trung mô (b), (hình ảnh soi trên kính hiển vi đảo ngượi - 50X)
Khi tế bào gốc trung mô màng dây rốn phát triển trong môi trƣờng nuôi cấy, tế bào cũng có xu hƣớng tạo ra 2 lớp chồng lấn lên nhau chứ không phát triển hình cuộn xoáy nhƣ Fibroblasts trung bì.
Theo dõi các ngày sau thay môi trƣờng biệt hóa, thấy tế bào mọc mạnh xếp chồng lấn lên nhau, khoảng ngày thứ 6-8.
Ngày thứ 10, lớp tế bào có xu hƣớng bong bật khỏi bề mặt đĩa, lắc nhẹ đĩa hoặc dùng đầu pipet gạt nhẹ là có thể tạo ra tấm tế bào. Tấm tế bào chỉ co nhỏ hơn diện tích đáy đĩa một chút, còn khoảng = 2/3 diện tích đĩa nuôi.
A B
Ảnh 3.13. Duy trì môi trường nuôi cấy 2 tuần, tế bào trong môi trường biệt hóa tạo thành tấm tế bào gốc trung mô, các tế bào mọc thành hai -3 lớp đan chéo nhau, tấm vật liệu bắt đầu bong (a), bờ mép dịch chuyển về phía trung tâm đĩa (b). (Soi nổi - 50X)
Về khía cạnh mô học, tấm vật liệu có chứa không chỉ tế bào đơn thuần mà còn bao gồm cả đệm gian bào.
Tấm vật liệu cho thấy trong thành phần của chúng chứa rất nhiều tế bào dạng nguyên bào sợi.
A B
Ảnh 3.14. Hình ảnh đại thể tấm vật liệu tương đương trung bì. (a) tấm vật liệu tạo ra sau 2 tuần nuôi cấy tế bào gốc trung mô trong môi trường biệt hóa thành nguyên bào sợi trong, tấm vật liệu dai và dễ tách ra khỏi bề mặt đĩa nuôi cấy. (b) Hình thái cấu trúc trên kính hiển vi quang học nhuộm HE của tấm vật liệu tương đương trung bì, tấm vật liệu có chứa không chỉ tế bào đơn thuần mà còn bao gồm cả đệm gian bào, Tấm vật liệu cho thấy trong thành phần của chúng chứa rất nhiều tế bào dạng nguyên bào sợi và đệm gian bào tương đối dày. (HE, 50X)
3.2. HIỆU QUẢ GHÉP TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ MÀNG DÂY RỐN TRONG ĐIỀU TRỊ VẾT THƢƠNG BỎNG NHIỆT THỰC NGHIỆM TRONG ĐIỀU TRỊ VẾT THƢƠNG BỎNG NHIỆT THỰC NGHIỆM 3.2.1. Thay đổi một số chỉ số toàn thân và xét nghiệm của thỏ trong ghép tế bào gốc trung mô
2.32 1.96 2.06 2.13 1.7 1.8 1.9 2 2.1 2.2 2.3 2.4 kg D0 D5 D10 D15
Biểu đồ 3.6. Thay đổi cân nặng thỏ nghiên cứu
Qua biểu đồ 3.6 cho thấy: Trọng lƣợng thỏ giảm ở những ngày đầu sau khi gây bỏng thực nghiệm.
Ở thời điểm 10 ngày sau khi gây bỏng (5 ngày sau khi ghép tấm trung bì), cân nặng của thỏ bắt đầu hối phục.
Đến thời điểm 15 ngày sau khi gây bỏng (10 ngày sau khi ghép tấm trung bì), cân nặng của thỏ trở về gần với giá trị ban đầu trƣớc khi gây bỏng.
Nhƣ vậy, sự giảm trọng lƣợng trong những ngày đầu sau gây bỏng là do tính chất của chấn thƣơng cấp tính, đau đớn, vết thƣơng bỏng rộng và sâu.
Bảng 3.8. Thay đổi các chỉ số huyết học thỏ nghiên cứu Chỉ số Thời điểm Chỉ số Thời điểm D0 D5 D10 Số lƣợng hồng cầu (x1012/L) 5,56 1,67 5,67 1,69 5,84 0,12 Huyết tắc số (g/L) 120,13 1,44 125,58 2,92 131,1 2,81 Hematocrit (%) 34,41 1,81 37,25 1,56 38,10 2,10 Số lƣợng bạch cầu (x109/L) 5,26 0,36 8,27 0,72 6,26 0,56 Bạch cầu N (%) 23,05 2,41 19,90 1,67 20,69 2,42 Bạch cầu L (%) 58,24 4,30 62,20 2,26 61,58 2,19
Số lƣợng hồng cầu, nồng độ huyết sắc tố và chỉ số hematocrit giảm nhẹ ở thời điểm 5 ngày sau bỏng và bắt đầu phục hồi ở thời điểm bắt đầu nghiên cứu cấy ghép tế bào điều trị vết thƣơng. Các chỉ số này phục hồi hoàn toàn vào thời điểm ngày thứ 10 nghiên cứu (ngày thứ 15 sau bỏng).
Số lƣợng bạch cầu tăng nhẹ ở thời điểm sau gây bỏng sau đó dần trở về bình thƣờng, không thấy dấu hiệu tăng bạch cầu ở các thời điểm sau ghép tế bào.
Bạch cầu đa nhân trung tính (N) không có dấu hiệu tăng trong khi bạch cầu lympho (L) có xu hƣớng tăng ít tại các thời điểm nghiên cứu vào ngày thứ 5 và thứ 10.
Bảng 3.9. Thay đổi các chỉ số sinh hoá máu liên quan chức năng thận Chỉ số Chỉ số Thời điểm D0 D5 D10 Glucose (mmol/L) 4,79 0,31 4,96 0,35 5,27 0,33 Ure (mmol/L) 5,34 0,47 5,2 0,41 5,10 0,27 Creatinin (mol/L) 93,8 4,86 94,6 5,48 96,04 5,63
Các chỉ số sinh hoá máu thể hiện chức năng thận và chuyển hoá không có sự thay đổi nhiều trong suốt quá trình nghiên cứu.
Giá trị các xét nghiệm này luôn trong giới hạn bình thƣờng.
Bảng 3.10. Hoạt độ enzym GOT, GPT huyết thanh
Chỉ số
Thời điểm
D0 D5 D10
SGOT (U/L) 50,16 2,81 67,54 5,37 52,98 3,14 SGPT (U/L) 54,14 5,38 69,56 5,35 68,13 4,63
Hoạt độ enzyme GOT, tăng nhẹ ở ngày thứ 5 sau đó giảm nhanh xuống mức độ bình thƣờng vào ngày thứ 10.
3.2.2. Ảnh hƣởng của ghép tế bào gốc trung mô tới liền vết thƣơng
3.2.2.1. Ảnh hƣởng của ghép tế bào gốc trung mô tới diễn biến lâm sàng tại chỗ vết thƣơng
Bảng 3.11. Diễn biến lâm sàng vết thương bỏng thực nghiệm
Thời điểm Vết thƣơng Vùng A Vùng B D0 - Nền vết thƣơng ẩm, giả mạc bám dễ bóc, ít viêm nề, tiết dịch vừa. - Bờ mép vết thƣơng viêm nề nhẹ.
- Nền vết thƣơng ẩm, giả mạc bám dễ bóc, ít viêm nề, tiết dịch vừa. - Bờ mép vết thƣơng viêm nề nhẹ.
D5
- Vết thƣơng sạch, tiết dịch ít. Vẩy tiết màu vàng sậm, phía dƣới nền có tổ chức hạt và dễ rƣớm máu. Vết thƣơng không có mùi hôi.
- Bờ mép vết thƣơng không viêm nề, không có ban dát sẩn.
- Vết thƣơng sạch, tiết dịch ít. Vẩy tiết dễ bóc, màu vàng nhạt, cạo sạch lớp vẩy tiết bên dƣới dễ chảy máu. Vết thƣơng không có mùi hôi.
- Bờ mép vết thƣơng còn viêm nề và xung huyết nhẹ.
D10
- Diện tích vết thƣơng thu nhỏ, nền có tổ chức hạt đẹp màu đỏ tƣơi. - Bờ mép vết thƣơng không có ban dát sẩn, xuất hiện rõ biểu mô hóa vào trung tâm vết thƣơng.
- Diện tích vết thƣơng co nhỏ lại nhƣng lớn hơn so với vùng A. Nền vết thƣơng ẩm, sạch, màu hồng nhạt, dịch tiết vừa. - Bờ mép VT không viêm nề. D15 - Nền vết thƣơng phẳng, không co dúm.
- Quầng biểu mô hóa từ bờ mép quan sát rõ.
- Nền vết thƣơng phẳng, rƣớm máu, có dấu hiệu co rút vết thƣơng
- Có biểu mô hóa từ bờ mép vết thƣơng lan vào trung tâm.
Bảng 3.12. Thay đổi diện tích vết thương bỏng
Thời điểm
Tỷ lệ % diện tích vết thƣơng đã liền
P
Vùng A (n = 30) Vùng B (n = 30)
D5 26,53 ± 12,04 25,84 ± 11,40 0,601 D10 77,44 ± 12,24 68,76 ± 11,14 < 0,01 D15 93,23 ± 3,74 87,36 ± 4,78 < 0,001 Ngày thứ 5, diện tích vết bỏng của vùng A khỏi nhanh hơn so với vùng B. Tuy nhiên, diện tích vết bỏng khỏi của vùng A và vùng B trong những ngày đầu sau ghép khác nhau không có ý nghĩa thống kế (p=0,601).
Ngày thứ 10 và 15, diện tích vết bỏng của vùng A liền nhanh vùng B rệt hơn (p<0,001).
Bảng 3.13. Tốc độ liền vết thương
Thời điểm Diện tích vết thƣơng thu hẹp (cm
2 /ngày) P Vùng A (n = 30) Vùng B (n = 30) Ngày thứ 1 - 5 0,93 ± 0,32 0,90 ± 0,29 0,488 Ngày thứ 5 – 10 1,77 ± 0,74 1,25 ± 0,28 <0,01 Ngày thứ 1 – 10 1,41 ± 0,33 1,28 ± 0,19 <0,01 Ngày thứ 1 - 15 1,12 ± 0,16 1,04 ± 0,13 < 0,01 Tốc độ thu hẹp vết thƣơng giữa vùng A và vùng B trong 5 ngày đầu khác nhau nhƣng chƣa có ý nghĩa thống kê (p>0,05). Nhƣng nếu so sánh sự thay đổi tốc độ thu hẹp vết thƣơng giữa vùng A và vùng B trong khoảng thời gian từ ngày thứ 1 đến ngày thứ 10 thì sự khác nhau có ý nghĩa thống với p<0,01.
Bảng 3.14. Liên quan thời gian và số vết thương liền hoàn toàn
Thời gian
Số vết thƣơng liền hoàn toàn
P Vùng A (n = 30) Vùng B (n = 30) Số thỏ Tỷ lệ % Số thỏ Tỷ lệ % Trƣớc 15 ngày 0 0 0 0 > 0,05 Ngày 16-20 14 46,67 12 40 > 0,05 Sau 20 ngày 16 53,33 18 60 > 0,05 Tổng 30 100 30 100
Trong giai đoạn 16 – 20 ngày, tỷ lệ vết bỏng vùng A khỏi hoàn toàn (46,67%) cao hơn so với vùng B ( 40%), tuy nhiên chƣa có ý nghĩa thống kê.
Bảng 3.15. Diện tích vùng biểu mô hóa sau khi liền
Thời điểm Diện tích (cm
2 ) P Vùng A (n=30) Vùng B (n=30) D5 4,68 ± 1,64 4,50 ± 1,48 0,488 D10 14,18 ± 3,33 12,52 ± 2,83 <0,05 D15 16,95 ± 2,31 15,74 ± 1,93 <0,05
Diện tích vùng biểu mô hóa ở vùng A lớn hơn vùng ở vùng B và có ý nghĩa thống kê với p<0,05 vào ngày nghiên cứu thứ thứ 10 và 15.
Ảnh 3.15. Vết bỏng sâu ngày thứ 5 sau bỏng đã được cắt lọc sạch hoại tử, chuẩn bị ghép tế bào gốc trung mô. Vùng nghiên cứu và vùng đối chứng tương đương nhau về độ sâu và diện tích.
Ảnh 3.16. Vết bỏng ở ngày nghiên cứu thứ 5, vùng A có dấu hiệu biểu mô hóa, vùng B có dấu hiệu viêm và xung huyết bờ mép vết thương.. biểu mô hóa, vùng B có dấu hiệu viêm và xung huyết bờ mép vết thương..
D0
Ảnh 3.17. Vết bỏng ngày nghiên cứu thứ 15, cả 2 vùng đều có tổ chức hạt đẹp và biểu mô hóa từ bờ mép vào trung tâm vết thương .Diện tích vết hạt đẹp và biểu mô hóa từ bờ mép vào trung tâm vết thương .Diện tích vết thương vùng A, thu hẹp hơn so với vùng B.
Ảnh 3.18. Vết bỏng ngày nghiên cứu thứ 20, vùng A khỏi hoàn toàn, sẹo mềm mại, màu trắng hồng, tương đồng với da lành. Trong khi đó vùng sẹo mềm mại, màu trắng hồng, tương đồng với da lành. Trong khi đó vùng
B vẫn còn khoảng 2cm2
vết thương chưa liền, vùng sẹo phẳng nhưng hơi cứng cộm.
D15
3.2.2.2. Ảnh hƣởng của ghép tế bào gốc trung mô đến thay đổi hình thái cấu trúc mô vết thƣơng
Bảng 3.16. Đặc điểm hình thái cấu trúc mô vết thương tại các thời điểm
Thời điểm
Đặc điểm hình thái mô
Vùng A (n=30) Vùng B (n=30)
Trƣớc ghép
Bề mặt tổn thƣơng không có hoại tử, đƣợc phủ lớp tơ huyết mỏng.
Mô phía dƣới có ít dịch phù xen kẽ ít tế bào viêm chủ yếu là bạch cầu đa nhân trung tính, rải rác các đại thực bào và nguyên bào sợi.
Bề mặt tổn thƣơng không có hoại tử, đƣợc phủ lớp tơ huyết mỏng.
Mô phía dƣới có ít dịch phù xen kẽ ít tế bào viêm chủ yếu là bạch cầu đa nhân trung tính, rải rác các đại thực bào và nguyên bào sợi.
Ngày thứ 5
Mô liên kết mỏng, có ít tế bào viêm, nhiều nguyên bào sợi và tân mạch, không có ít dịch phù viêm
Mô liên kết dày, nhiều tế bào viêm, nguyên bào sợi và tân mạch, còn phù viêm nhẹ
Ngày thứ 10
Mô liên kết rất ít tế bào viêm, ít nguyên bào sợi và tân mạch Có 20/30 vết thƣơng đã đƣợc che phủ bởi lớp biểu bì mỏng nhƣng chƣa đủ 4 lớp.
Lớp tế bào biểu bì liên kết chặt chẽ với chân bì, lớp tế bào mầm tăng phân chia
Mô liên kết còn nhiều tế bào viêm nhƣng ít hơn trƣớc, không còn phù viêm, nhiều nguyên bào sợi và tân mạch. Có 16/30 vết thƣơng đã có biểu bì che phủ, có sự phân chia của tế bào lớp mầm.
Bảng 3.17. Thay đổi số lượng tế bào viêm tại mô vết thương
Thời điểm Số lƣợng tế bào viêm/ĐVDT
Vùng A (n=30) Vùng B (n=30) P D0 30,16 7,41 31,46 5,98 0,375
D5 18,86 4,46 18,01 5,08 0,475
D10 08,96 1,80 12,50 3,01 0,001 Số lƣợng tế bào viêm cả 2 vùng đều giảm theo tiến trình nghiên cứu. Tại thời điểm 10 ngày nghiên cứu (15 ngày sau gây bỏng), vùng A có số lƣợng tế bào viêm thấp hơn so với vùng B và sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P<0,001).
Bảng 3.18. Thay đổi số lượng nguyên bào sợi tại mô vết thương
Thời điểm Số lƣợng nguyên bào sợi/ĐVDT
Vùng A (n=30) Vùng B (n=30) P D0 13,86 5,40 13,53 03,13 0,714
D5 37,20 8,26 36,56 9,35 0,76
D10 67,10 9,09 52,73 10,38 <0,001
Số lƣợng nguyên bào sợi ở cả vùng nghiên cứu ghép tế tấm trung bì và vùng đối chứng tăng lên dần trong 10 ngày nghiên cứu và tăng cao vào ngày thứ 10. So sánh tại các thời điểm trƣớc nghiên cứu ghép tế bào, ngày thứ 5 thấy số lƣợng nguyên bào sợi tại mô vết thƣơng vùng nghiên cứu và vùng đối chứng là tƣơng đƣơng nhau. Ngày thứ 10 thấy số lƣợng nguyên bào sợi vùng A tăng hơn vùng B với p< 0,001.
Bảng 3.19. Thay đổi số lượng tân mạch tại mô vết thương
Thời điểm Số lƣợng tân mạch/ĐVDT
Vùng A (n=30) Vùng B (n=30) P
D5 3,50 1,04 3,67 1,02 0,484
D10 7,23 1,13 4,90 0,95 0,001 Tại thời điểm ngày nghiên cứu thứ 10, số lƣợng tân mạch tăng lên so với thời điểm ngày nghiên cứu thứ 5 tại cả vùng A lẫn vùng B.
Số lƣợng tân mạch ở vùng A tại thời điểm ngày nghiên cứu thứ 10 (ngày thứ 15 sau khi gây bỏng) cao hơn có ý nghĩa thống kê so với vùng B với p <0,001.
Bảng 3.20. Thay đổi chỉ số phân bào lớp mầm tại mô vết thương
Thời điểm Chỉ số phân bào (có hiệu chỉnh MI x 100) Vùng A (n=30) Vùng B (n=30) P
D5 1,53 0,50 1,47 0,51 0,189
D10 2,47 0,56 1,86 0,51 0,010 Ở ngày nghiên cứu thứ 5, chỉ số phân bào lớp mầm mô vết thƣơng vùng A cao hơn vùng B nhƣng không có ý nghĩa thống kê (p=0,189).
Tại thời điểm ngày nghiên cứu thứ 10, chỉ số phân bào tăng hơn so với ngày thứ 5, đặc biệt vùng A tăng cao hơn so với vùng B có ý nghĩa thông kê (p<0,01).
Ảnh 3.19. Hình thái cấu trúc mô vết thương vùng A trước ghép tế bào, chủ yếu tế bào viêm (1) và dịch phù (2), có màng tơ huyết trên bề mặt vết thương (3), rất ít nguyên bào sợi và chưa thấy tân mạch. Thỏ số AS 23, HE, 10X.
Ảnh 3.20. Vết thương vùng A ngày nghiên cứu thứ 5, đã có nhiều nguyên bào sợi (1) bắt đầu xuất hiện các tân mạch (2), ít phù viêm và tế bào viêm. Thỏ AS23, HE, 10X.
2
1
1 2
Ảnh 3.21. Mô vết thương vùng A ở ngày nghiên cứu thứ 10, nhiều nguyên bào sợi sắp xếp có định hướng (1), nhiều tân mạch (2), lớp biểu mô liên kết chặt chẽ với chân bì (3), ít tế bào viêm. Thỏ số AS 23, HE, 10X.
3.2.3. Vi khuẩn học vết thƣơng bỏng thực nghiệm
Bảng 3.21. Tần xuất xuất hiện vi khuẩn qua các thời điểm nghiên cứu
Thời điểm
Tỷ lệ vết thƣơng có mẫu cấy khuẩn dƣơng tính Vùng A (n = 30) Vùng B (n = 30) Số mẫu (+) Tỷ lệ % Số mẫu (+) Tỷ lệ % D0 1 3,33 3 10,00 D5 5 16,67 7 23,33 D10 4 13,33 3 10,00 Tổng 10 33,33 13 43,33
Tần xuất cấy khuẩn dƣơng tính ở vùng nghiên cứu không cao hơn so với vùng đối chứng.
2 1
30% 40% 10% 10% 10% E.cloaceae E.coli S.aureus P.mirabilis K.pneumoniae
Biểu đồ 3.7. Chủng loại vi khuẩn vết thƣơng vùng nghiên cứu (Vùng A)
15.38% 7.69% 7.69% 7.69% 15.38% 38.48% 7.69% E.cloaceae E.coli S.aureus P.mirabilis K.pneumoniae Aci. Baumannii Shi.boydi
Qua biểu đồ 3.7 và 3.8 cho thấy:
- Chủng loại vi khuẩn vùng A bao gồm: E. cloaceae, E. coli, S. aureus, P. mirabilis, K, pneumonia. Trong khi đó, ở vùng B gặp các loài vi khuẩn là: Aci. Baumanni, E.coli, E.cloaceae, Shi.boydi, P.mirabilis, S. aureus, K.pneumoniae
- Tỷ lệ vết thƣơng nhiễm khuẩn E.coli và E.cloaceae chiếm cao hơn các chủng vi khuẩn khác.
Bảng 3.22. Thay đổi số lượng vi khuẩn vết thương
Thời điểm Số lƣợng vi khuẩn (5103/cm2) Vùng A (n = 30) Vùng B (n = 30) P D0 05,67 ± 31,07 9,02 ± 28,40 0,575 D5 16,06 ± 37,15 22,87 ± 42,98 0,108 D10 10,57 ± 27,96 7,22 ± 22,21 0,343
Xét tại vùng A và vùng B thì số lƣợng vi khuẩn tăng cao ở lần 2 (thời