Thời điểm Diện tích (cm
2 ) P Vùng A (n=30) Vùng B (n=30) D5 4,68 ± 1,64 4,50 ± 1,48 0,488 D10 14,18 ± 3,33 12,52 ± 2,83 <0,05 D15 16,95 ± 2,31 15,74 ± 1,93 <0,05
Diện tích vùng biểu mô hóa ở vùng A lớn hơn vùng ở vùng B và có ý nghĩa thống kê với p<0,05 vào ngày nghiên cứu thứ thứ 10 và 15.
Ảnh 3.15. Vết bỏng sâu ngày thứ 5 sau bỏng đã được cắt lọc sạch hoại tử, chuẩn bị ghép tế bào gốc trung mô. Vùng nghiên cứu và vùng đối chứng tương đương nhau về độ sâu và diện tích.
Ảnh 3.16. Vết bỏng ở ngày nghiên cứu thứ 5, vùng A có dấu hiệu biểu mô hóa, vùng B có dấu hiệu viêm và xung huyết bờ mép vết thương.. biểu mô hóa, vùng B có dấu hiệu viêm và xung huyết bờ mép vết thương..
D0
Ảnh 3.17. Vết bỏng ngày nghiên cứu thứ 15, cả 2 vùng đều có tổ chức hạt đẹp và biểu mô hóa từ bờ mép vào trung tâm vết thương .Diện tích vết hạt đẹp và biểu mô hóa từ bờ mép vào trung tâm vết thương .Diện tích vết thương vùng A, thu hẹp hơn so với vùng B.
Ảnh 3.18. Vết bỏng ngày nghiên cứu thứ 20, vùng A khỏi hoàn toàn, sẹo mềm mại, màu trắng hồng, tương đồng với da lành. Trong khi đó vùng sẹo mềm mại, màu trắng hồng, tương đồng với da lành. Trong khi đó vùng
B vẫn còn khoảng 2cm2
vết thương chưa liền, vùng sẹo phẳng nhưng hơi cứng cộm.
D15
3.2.2.2. Ảnh hƣởng của ghép tế bào gốc trung mô đến thay đổi hình thái cấu trúc mô vết thƣơng
Bảng 3.16. Đặc điểm hình thái cấu trúc mô vết thương tại các thời điểm
Thời điểm
Đặc điểm hình thái mô
Vùng A (n=30) Vùng B (n=30)
Trƣớc ghép
Bề mặt tổn thƣơng không có hoại tử, đƣợc phủ lớp tơ huyết mỏng.
Mô phía dƣới có ít dịch phù xen kẽ ít tế bào viêm chủ yếu là bạch cầu đa nhân trung tính, rải rác các đại thực bào và nguyên bào sợi.
Bề mặt tổn thƣơng không có hoại tử, đƣợc phủ lớp tơ huyết mỏng.
Mô phía dƣới có ít dịch phù xen kẽ ít tế bào viêm chủ yếu là bạch cầu đa nhân trung tính, rải rác các đại thực bào và nguyên bào sợi.
Ngày thứ 5
Mô liên kết mỏng, có ít tế bào viêm, nhiều nguyên bào sợi và tân mạch, không có ít dịch phù viêm
Mô liên kết dày, nhiều tế bào viêm, nguyên bào sợi và tân mạch, còn phù viêm nhẹ
Ngày thứ 10
Mô liên kết rất ít tế bào viêm, ít nguyên bào sợi và tân mạch Có 20/30 vết thƣơng đã đƣợc che phủ bởi lớp biểu bì mỏng nhƣng chƣa đủ 4 lớp.
Lớp tế bào biểu bì liên kết chặt chẽ với chân bì, lớp tế bào mầm tăng phân chia
Mô liên kết còn nhiều tế bào viêm nhƣng ít hơn trƣớc, không còn phù viêm, nhiều nguyên bào sợi và tân mạch. Có 16/30 vết thƣơng đã có biểu bì che phủ, có sự phân chia của tế bào lớp mầm.
Bảng 3.17. Thay đổi số lượng tế bào viêm tại mô vết thương
Thời điểm Số lƣợng tế bào viêm/ĐVDT
Vùng A (n=30) Vùng B (n=30) P D0 30,16 7,41 31,46 5,98 0,375
D5 18,86 4,46 18,01 5,08 0,475
D10 08,96 1,80 12,50 3,01 0,001 Số lƣợng tế bào viêm cả 2 vùng đều giảm theo tiến trình nghiên cứu. Tại thời điểm 10 ngày nghiên cứu (15 ngày sau gây bỏng), vùng A có số lƣợng tế bào viêm thấp hơn so với vùng B và sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P<0,001).
Bảng 3.18. Thay đổi số lượng nguyên bào sợi tại mô vết thương
Thời điểm Số lƣợng nguyên bào sợi/ĐVDT
Vùng A (n=30) Vùng B (n=30) P D0 13,86 5,40 13,53 03,13 0,714
D5 37,20 8,26 36,56 9,35 0,76
D10 67,10 9,09 52,73 10,38 <0,001
Số lƣợng nguyên bào sợi ở cả vùng nghiên cứu ghép tế tấm trung bì và vùng đối chứng tăng lên dần trong 10 ngày nghiên cứu và tăng cao vào ngày thứ 10. So sánh tại các thời điểm trƣớc nghiên cứu ghép tế bào, ngày thứ 5 thấy số lƣợng nguyên bào sợi tại mô vết thƣơng vùng nghiên cứu và vùng đối chứng là tƣơng đƣơng nhau. Ngày thứ 10 thấy số lƣợng nguyên bào sợi vùng A tăng hơn vùng B với p< 0,001.
Bảng 3.19. Thay đổi số lượng tân mạch tại mô vết thương
Thời điểm Số lƣợng tân mạch/ĐVDT
Vùng A (n=30) Vùng B (n=30) P
D5 3,50 1,04 3,67 1,02 0,484
D10 7,23 1,13 4,90 0,95 0,001 Tại thời điểm ngày nghiên cứu thứ 10, số lƣợng tân mạch tăng lên so với thời điểm ngày nghiên cứu thứ 5 tại cả vùng A lẫn vùng B.
Số lƣợng tân mạch ở vùng A tại thời điểm ngày nghiên cứu thứ 10 (ngày thứ 15 sau khi gây bỏng) cao hơn có ý nghĩa thống kê so với vùng B với p <0,001.
Bảng 3.20. Thay đổi chỉ số phân bào lớp mầm tại mô vết thương
Thời điểm Chỉ số phân bào (có hiệu chỉnh MI x 100) Vùng A (n=30) Vùng B (n=30) P
D5 1,53 0,50 1,47 0,51 0,189
D10 2,47 0,56 1,86 0,51 0,010 Ở ngày nghiên cứu thứ 5, chỉ số phân bào lớp mầm mô vết thƣơng vùng A cao hơn vùng B nhƣng không có ý nghĩa thống kê (p=0,189).
Tại thời điểm ngày nghiên cứu thứ 10, chỉ số phân bào tăng hơn so với ngày thứ 5, đặc biệt vùng A tăng cao hơn so với vùng B có ý nghĩa thông kê (p<0,01).
Ảnh 3.19. Hình thái cấu trúc mô vết thương vùng A trước ghép tế bào, chủ yếu tế bào viêm (1) và dịch phù (2), có màng tơ huyết trên bề mặt vết thương (3), rất ít nguyên bào sợi và chưa thấy tân mạch. Thỏ số AS 23, HE, 10X.
Ảnh 3.20. Vết thương vùng A ngày nghiên cứu thứ 5, đã có nhiều nguyên bào sợi (1) bắt đầu xuất hiện các tân mạch (2), ít phù viêm và tế bào viêm. Thỏ AS23, HE, 10X.
2
1
1 2
Ảnh 3.21. Mô vết thương vùng A ở ngày nghiên cứu thứ 10, nhiều nguyên bào sợi sắp xếp có định hướng (1), nhiều tân mạch (2), lớp biểu mô liên kết chặt chẽ với chân bì (3), ít tế bào viêm. Thỏ số AS 23, HE, 10X.
3.2.3. Vi khuẩn học vết thƣơng bỏng thực nghiệm
Bảng 3.21. Tần xuất xuất hiện vi khuẩn qua các thời điểm nghiên cứu
Thời điểm
Tỷ lệ vết thƣơng có mẫu cấy khuẩn dƣơng tính Vùng A (n = 30) Vùng B (n = 30) Số mẫu (+) Tỷ lệ % Số mẫu (+) Tỷ lệ % D0 1 3,33 3 10,00 D5 5 16,67 7 23,33 D10 4 13,33 3 10,00 Tổng 10 33,33 13 43,33
Tần xuất cấy khuẩn dƣơng tính ở vùng nghiên cứu không cao hơn so với vùng đối chứng.
2 1
30% 40% 10% 10% 10% E.cloaceae E.coli S.aureus P.mirabilis K.pneumoniae
Biểu đồ 3.7. Chủng loại vi khuẩn vết thƣơng vùng nghiên cứu (Vùng A)
15.38% 7.69% 7.69% 7.69% 15.38% 38.48% 7.69% E.cloaceae E.coli S.aureus P.mirabilis K.pneumoniae Aci. Baumannii Shi.boydi
Qua biểu đồ 3.7 và 3.8 cho thấy:
- Chủng loại vi khuẩn vùng A bao gồm: E. cloaceae, E. coli, S. aureus, P. mirabilis, K, pneumonia. Trong khi đó, ở vùng B gặp các loài vi khuẩn là: Aci. Baumanni, E.coli, E.cloaceae, Shi.boydi, P.mirabilis, S. aureus, K.pneumoniae
- Tỷ lệ vết thƣơng nhiễm khuẩn E.coli và E.cloaceae chiếm cao hơn các chủng vi khuẩn khác.
Bảng 3.22. Thay đổi số lượng vi khuẩn vết thương
Thời điểm Số lƣợng vi khuẩn (5103/cm2) Vùng A (n = 30) Vùng B (n = 30) P D0 05,67 ± 31,07 9,02 ± 28,40 0,575 D5 16,06 ± 37,15 22,87 ± 42,98 0,108 D10 10,57 ± 27,96 7,22 ± 22,21 0,343
Xét tại vùng A và vùng B thì số lƣợng vi khuẩn tăng cao ở lần 2 (thời điểm 5 ngày sau khi bắt đầu ghép tế bào) nhƣng sau đó giảm ở lần 3 (ngày thứ 10 sau khi ghép tế bào).
0 5 10 15 20 25 D0 D5 D10 Vùng A Vùng B
Biểu đồ 3.9. Thay đổi số lƣợng vi khuẩn tại vết bỏng
Số lƣợng vi khuẩn trên 1cm2 vết thƣơng ở hai vùng nghiên cứu không có sự khác biệt tại các thời điểm lấy mẫu xét nghiệm.
Cả 2 vùng vết thƣơng đều có mật độ vi khuẩn thấp nên ít có khả năng ảnh hƣởng đến quá trình liền vết thƣơng.
Vết thƣơng đƣợc ghép tấm tế bào cũng không làm tăng sự phát triển vi khuẩn tại vết thƣơng mặc dù không sử dụng thuốc kháng khuẩn tại chỗ vết thƣơng.
CHƢƠNG 4 BÀN LUẬN
4.1. ĐẶC ĐIỂM PHÂN LẬP NUÔI CẤY, BIỆT HÓA TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ MÀNG DÂY RỐN
4.1.1. Phân lập tế bào gốc trung mô màng dây rốn
Tế bào gốc trung mô, lớp tế bào gốc thuộc trung bì có khả năng biệt hóa thành nhiều dòng tế bào [54]. Tế bào gốc trung mô dây rốn có thể dễ dàng thu đƣợc. Do việc sử dụng chúng không bị các vƣớng mắc về vấn đề đạo đức, dây rốn là sự lựa chọn tối ƣu cho việc phân lập tế bào gốc trung mô [6],[14],[119]. Nhiều nghiên cứu khẳng định rằng đặc tính sinh học và hình thái tế bào của tế bào gốc trung mô dây rốn rất giống tế bào gốc trung mô tủy xƣơng và tế bào gốc trung mô dây rốn có thể biệt hóa thành tế bào cơ tim, mỡ, và thần kinh [46], [54],[55]. Tuy nhiên, khả năng tăng sinh và biệt hóa của tế bào gốc trung mô dây rốn tốt hơn nhiều so với tế bào gốc trung mô tủy xƣơng [56]. Hochedlinger và cộng sự [57] đã xác định OCT-4 cũng có biểu hiện ở các tế bào gốc trung mô dây rốn. OCT-4 là một gene đặc biệt của tế bào gốc phôi, có vai trò quan trọng trong việc duy trì tình trạng không biệt hóa của tế bào gốc. Kết quả này chỉ ra rằng tế bào gốc trung mô sơ hữu ít nhất là một số đặc tính của tế bào gốc. Hơn nữa, nghiên cứu cũng chỉ ra rằng tế bào gốc trung mô có thể hữu ích trong tái tạo vết thƣơng và trong y học tái tạo [58], [59].
Trong nghiên cứu này, tế bào gốc trung mô giống nguyên bào sợi đƣợc tinh lọc thu đƣợc thông qua phƣơng pháp có thay đổi chút ít so với phƣơng pháp đã mô tả và xuất bản trƣớc đây [60]. Đối với nguồn tế bào gốc trung mô ngƣời, lớp thạch đƣợc phân tách thay cho việc dùng toàn bộ mô dây rốn để tránh nhiễm tế bào biểu mô. Khi tách tế bào gốc trung mô dây rốn bằng
phƣơng pháp này, nhiều cách thức khác cũng đƣợc khảo sát nhƣ dùng collagenase, trypsin, hyaluronidase.[61], [89], [92].
Nghiên cứu của chúng tôi không sử dụng enzyme để phân lập tế bào mà sử dụng phƣơng pháp kết dính mô vào bề mặt nuôi cấy để các tế bào tự mọc ra khỏi mẫu mô. Một số nghiên cứu trƣớc đây cũng đã áp dụng mô hình phân lập tế bào gốc tƣơng tự mà không cần dùng enzyme [136],[137]. Với phƣơng pháp này, Lê Văn Đông và cộng sự, sau khi nuôi cấy mô, 100% số mẫu có tế bào mọc lan ra khỏi mẩu mô, mẫu xuất hiện tế bào sớm nhất vào ngày 3 và muộn nhất vào ngày 17. Sau khi nuôi cấy vài ngày, các mảnh mô co lại, bám chặt hơn vào bề mặt đĩa nuôi và bắt đầu xuất hiện các tế bào lan ra xung quanh rìa mép của mảnh mô [14].
Kết quả của chúng tôi tƣơng đối phù hợp với tác giả trên, có 15/17 mẫu mô nghiên cứu mọc tế bào ra khỏi mẩu mô trong 3 tuần sau nuôi cấy mô, đạt tỷ lệ 88,2% và cũng chỉ cần nuôi cấy trong hai tuần là đã có thể thu hoạch tế bào. Khoảng 10-14 ngày sau khi bắt đầu cấy mô, có dấu hiệu một số tế bào di cƣ từ mẩu mô nuôi cấy ra bề mặt đĩa nhựa. Các tế bào dây rốn mọc ra khỏi mẫu mô trong điều kiện nuôi cấy có đặc điểm về hình thái là tế bào có hình sao hoặc hình thoi chiếm chủ yếu, có phát hiện một số tế bào có hình ovan hoặc hình đa diện nhƣng ít. Không thấy có kết nối nhánh bào tƣơng khi quan sát ở độ phóng đại lớn. Tế bào có dấu hiệu phát triển lan rộng ra khỏi mẫu mô ở dạng đơn lớp mà không thấy sự biệt hóa nhiều lớp.
Kết quả nghiên cứu các dấu ấn bề mặt tế bào cho thấy tế bào gốc trung mô có biểu hiện mạnh các dấu ấn CD44, CD29, CD105, và HLA-ABC, nhƣng không có CD34, HLA-DR, CD31 hoặc CD45 [62],[63],[65],[66]. Nhƣ vậy, tế bào gốc trung mô dây rốn biểu hiện các kháng nguyên đặc biệt của tế bào trung mô mà không biểu hiện dấu ấn tế bào gốc tạo máu hay tế bào nội mô. Kết quả về hình thái tế bào, dấu ấn bề mặt và khả năng biệt hóa nhiều
dòng tế bào nói chung đƣợc sử dụng nhƣ các chỉ tiêu đánh giá để xác định tế bào gốc trung mô. Dựa vào những kết quả trên đây, chúng tôi tin rằng các tế bào bám dính bề mặt nuôi cấy đƣợc phân lập từ dây rốn đúng là tế bào gốc trung mô, mà đã đƣợc cho rằng tế bào gốc trung mô cũng tồn tại ở dây rốn cũng nhƣ ở tủy xƣơng và các mô khác [90],[119].
Kết hợp kết quả nghiên cứu của các tác giả khác với việc khảo sát của chúng tôi, có thể khẳng định tế bào gốc trung mô màng dây rốn có tính gốc mạnh hơn so với các tế bào trung mô khác .
4.1.2. Một số đặc tính của tế bào gốc trung mô dây rốn
4.1.2.1. Khả năng tạo colony của tế bào gốc trung mô dây rốn
Để xác định khả năng tăng trƣởng của tế bào gốc trung mô, chúng tôi tiến hành phân tích khả năng tạo colony (CFU-F). Tế bào tách từ 5 mẫu mô đƣợc thử khả năng tạo CF-E đều thấy xuất hiện các collony. Các collony đều có thể thấy xuất hiện sớm trong vòng 05 ngày thí nghiệm, các colony lúc này có khoảng 3-4 tế bào và đã thấy rõ trong vòng 10 ngày.
Tỷ lệ colony trong tập hợp số tế bào tách ra khỏi mẫu mô đạt cao, thấp nhất là 66% và cao nhất là 77%. Các mẫu nghiên cứu cho thấy, tế bào gốc trung mô phát triển tốt và tạo ra số lƣợng lớn các colony (gần 30 colonies) và đƣờng kính của colony cũng đạt hơn 2mm..
Nhƣ vậy, nghiên cứu này chỉ ra rằng tế bào gốc trung mô phân lập đƣợc duy trì khả năng di truyền. Kích thƣớc colony lớn cũng gợi ý rằng chúng có khả năng tăng sinh và cả khả năng di cƣ.
4.1.2.2. Tế bào gốc trung mô dây rốn có tính sinh miễn dịch thấp
Đặc điểm kháng nguyên HLA ở tế bào gốc trung mô dây rốn
Kết quả ở biểu đồ 3.2 cho thấy, trên 98% số tế bào thuộc quần thể TBGTM màng dây rốn nằm trong vùng M1, là vùng âm tính với tín hiệu huỳnh quang FITC gắn với kháng thể kháng HLA-DR. Trong khi đó, trên
92% số tế bào này nằm trong vùng M2 khi phân tích với kháng thể kháng CD90, thể hiện các tế bào này dƣơng tính với CD90 là một dấu ấn đặc trƣng của TBGTM đƣợc dùng nhƣ chứng dƣơng trong cùng lần phân tích. Điều này cũng tái khẳng định tế bào đƣợc phân tích là TBGTM. Kết quả phân tích 15 mẫu TBGTM màng dây rốn cho mức độ biểu hiện của HLA chỉ ở mức 1,95 ± 1,53%.
Theo qui ƣớc của Ủy ban Tế bào gốc mô và trung mô của Hội Liệu pháp tế bào quốc tế (ISCT), một marker đƣợc cho là âm tính khi đánh giá bằng kỹ thuật flowcytometry phải có tỉ lệ phần trăm dƣơng tính nhỏ hơn 2% trong tổng số tế bào dƣơng tính [5]. Từ đó cho thấy, TBGTM màng dây rốn đƣợc phân tích trong nghiên cứu này âm tính với HLA-DR. Kết quả nghiên cứu này cũng tƣơng tự nhƣ các ghi nhận của của Miki và CS (2005) với tế bào biểu mô màng ối [7] và Deuse và CS (2011) với tế bào gốc màng dây rốn [5], đều là các tế bào có nguồn gốc nhũ nhi.
HLA-G và HLA-E là các phân tử HLA thuộc lớp HLA lớp I, bộc lộ chủ yếu ở các tế bào của thai nhi, có tác dụng ức chế miễn dịch giúp cho thai nhi tồn tại đƣợc trong cơ thể ngƣời mẹ [8]. HLA-DR là kháng nguyên thuộc HLA lớp II, có tính sinh miễn dịch mạnh khi đƣợc cấy ghép vào cơ thể dị gen [3]. Các kết quả thu đƣợc từ nghiên cứu này, một lần nữa cho thấy, việc tồn tại các phân tử HLA-G và HLA-E nhƣng không bộc lộ HLA-DR trên các TBGTM màng dây rốn đã cung cấp một “đặc ƣu miễn dịch” giúp cho các