3.1.3.1. Thay đổi về hình thái và dấu ấn tế bào trong quá trình biệt hóa
Bảng 3.4. Tỷ lệ % hình dạng tế bào biệt hóa qua các thế hệ tế bào
Thế hệ tế
bào Hình sao Hình thoi Hình sợi
Hình dạng khác
P5 69,0 19,9 5,9 5,2
P10 35,8 47,8 9,8 0,6
P15 23,4 61,5 15,1 00
Tỷ lệ các tế bào hình thoi và sợi tăng dần theo các thế hệ tế bào khi nghiên cứu nuôi cấy trong môi trƣờng định hƣớng biệt hóa.
A B
Ảnh 3.7. Biến đổi hình thái tế bào ngày thứ 7 trong quá trình biệt hóa. (A) Tế bào gốc trung mô đối chứng. (B) Tế bào dạng nguyên bào sợi trong môi trường định hướng (soi ngược 50X)
Bảng 3.5. Phân tích hình thái và nhận xét sự biến đổi hình thái tế bào trong quá trình biệt hóa qua các thế hệ tế bào trong quá trình biệt hóa qua các thế hệ tế bào
P Hình dạng Bào tƣơng Nhân
P5
Đa số tế bào hình sao và hình thoi, có một số tế bào hình ovan và đa diện, rất ít tế bào hình sợi dài và mảnh.
Bào tƣơng trải rộng, thấy rõ các nhánh bào tƣơng,
Đa số hình trứng và hình tron, kích thƣớc to, khoảng bào tƣơng từ nhân đến màng tế bào còn rộng, không có hình nhân quái. Một số nhân tế bào nhỏ hơn thuộc về các tế bào có hình dạng sợi dài, khoảng bào tƣơng từ nhân đến màng tế bào hẹp.
P10
Các tế bào hình sao và hình thoi là chủ yếu nhƣng số các tế bào hình thoi chiếm ƣu thế, các tế bào hình sao ít hơn, nhiều tế bào hình sợi dài, không thấy tế bào hình oavn và đa diện
Bào tƣơng trải rộng, thấy rõ, các nhánh bào tƣơng kéo dài về 2 cực của tế bào
Đa số nhân hình trứng, chỉ có một số nhân hình tròn, kích thƣớc nhân to, không có nhân quái.
Số lƣợng tế bào có nhân nhỏ nhiều hơn P5
P15
Các tế bào hình sợi dài chiếm ƣu thế, còn ít tế bào hình thoi và hình sao. Không còn tế bào hình oval và đa diện
Bào tƣơng trải rộng và dài về 2 cực của tế bào,
Hầu hết nhân hình trứng thuôn về hai cực của tế bào, hình dạng nhẵn, không có nhân quái.
A
B
Ảnh 3.8. Biến đổi hình thái tế bào. (A) Tế bào gốc trung mô đối chứng ở P1 đa số hình sao và hình thoi. (B) Tế bào biệt hóa từ tế bào gốc chứng ở P1 đa số hình sao và hình thoi. (B) Tế bào biệt hóa từ tế bào gốc trung mô P5, tế bào thuôn dài, chủ yếu hình thoi, các tế bào nằm cạnh nhau và phát triển đạng xoáy. (giemsa 100x)
Bảng 3.6. Tỷ lệ % hình dạng nhân tế bào biệt hóa
Thế hệ tế bào
Nhân tế bào biệt hóa Hình tròn Hình trứng Đang phân
chia Nhân quái
P5 70,7 26,2 3,1 00
P10 38,8 58,0 3,4 00
P15 17,4 80,9 1,7 00
Tỷ lệ tế bào có nhân hình trứng là hình dạng đặc trƣng của nhân nguyên bào sợi, hình dạng này tăng dần theo các thế hệ tế bào biệt hóa. Các tế bào vẫn giữ đƣợc khả năng phân chia.
Ảnh 3.9. Hình dạng tế bào và bào tương tế bào biệt hóa dạng nguyên bào sợi, tế bào dạng hình thoi, dài (soi nổi 50X)
Ảnh 3.10. Hình dạng nhân và bào tương tế bào biệt hóa dạng nguyên bào sợi. Tế bào dạng hình thoi, dài nhân hình trứng (giemsa 100X)
A B
Ảnh 3.11. Hình thái siêu cấu trúc ảnh tế bào biệt hóa. Tế bào có những nếp gấp bào tương các bào quan phong phú, có nhiều hạt chế tiết (A những nếp gấp bào tương các bào quan phong phú, có nhiều hạt chế tiết (A -5.000X); Lưới nội bào có hạt phát triển dầy đặc trong bào tương, một số có hạt chế tiết, (B - 30.000X)
3.1.3.2. Khả năng chế tiết collagen và tạo tấm vật liệu tƣơng đƣơng trung bì của tế bào gốc trung mô
Bảng 3.7. Hàm lượng collagen hòa tan (µg/ml)
Mẫu xét nghiệm Nhóm tế bào Nhóm chứng (TBGTM) Nhóm nghiên cứu (NBS biệt hóa) P
Môi trƣờng nuôi cấy
(n=5) 0,045 ± 0,002 0,046 ± 0,001 >0,05 Dịch nổi nuôi cấy
(n=5) 0,069 ± 0,003 0,297 ± 0,011 <0,01
P >0,05 <0,001
Ở môi trƣờng tăng trƣởng, hàm lƣợng collagen chính là lƣợng collagen hòa tan ở huyết thanh bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy. Hàm lƣợng collagen ở dịch nổi nuôi cấy trƣớc khi biệt hóa tế bào là giống nhau giữa mẫu tế bào chuẩn bị biệt hóa và mẫu tế bào không tiến hành biệt hóa.
Trong dịch nổi nuôi cấy tế bào gốc trung mô, tuy hàm lƣợng collagen ở dịch nổi nuôi cấy tế bào có cao hơn so với trong môi trƣờng tăng trƣởng nhƣng không đáng kế.
Hàm lƣợng collagen ở dịch nổi tế bào nguyên bào sợi biệt hóa từ tế bào gốc trung mô cao hơn so với chính môi trƣờng tăng trƣởng trƣớc khi nuôi cấy (p<0,001) và cao hơn so với dịch nổi nuôi cấy tế bào gốc trung mô trong cùng khoảng thời gian nuôi cấy (p<0,01).
Nhƣ vậy, tế bào biệt hóa từ tế bào gốc trung mô dây rốn có khả năng tổng hợp collagen mạnh hơn so với tế bào gốc trung mô trƣớc biệt hóa.
Hai tuần nuôi cấy tính từ sau khi tế bào đạt 100% độ che phủ, các tế bào trung mô đƣợc duy trì trong môi trƣờng nuôi cấy biệt hóa, các tế bào hình thoi dài phát triển chồng lấn lên nhau khoảng 2-3 lớp đan chéo nhau theo nhiều hƣớng và có sự liên kết với nhau (ảnh 3.12a). Trong khi đó tế bào nuôi cấy trong điều kiện truyền thống không có yếu tố bổ sung, các tế bào vẫn phát triển đơn lớp, các tế bào nhiều hình dạng nằm cạnh nhau trong đó có các tế bào hình sao, hình thoi ngắn hơn (ảnh 3.12b).
A B
Ảnh 3.12. Tế bào mọc thành hai lớp đan chéo nhau ở ngày thứ 5 trong môi trường biệt hóa (a), trong khi tế bào vẫn duy trì 1 lớp ở môi trong môi trường biệt hóa (a), trong khi tế bào vẫn duy trì 1 lớp ở môi trường tăng trưởng cho tế bào gốc trung mô (b), (hình ảnh soi trên kính hiển vi đảo ngượi - 50X)
Khi tế bào gốc trung mô màng dây rốn phát triển trong môi trƣờng nuôi cấy, tế bào cũng có xu hƣớng tạo ra 2 lớp chồng lấn lên nhau chứ không phát triển hình cuộn xoáy nhƣ Fibroblasts trung bì.
Theo dõi các ngày sau thay môi trƣờng biệt hóa, thấy tế bào mọc mạnh xếp chồng lấn lên nhau, khoảng ngày thứ 6-8.
Ngày thứ 10, lớp tế bào có xu hƣớng bong bật khỏi bề mặt đĩa, lắc nhẹ đĩa hoặc dùng đầu pipet gạt nhẹ là có thể tạo ra tấm tế bào. Tấm tế bào chỉ co nhỏ hơn diện tích đáy đĩa một chút, còn khoảng = 2/3 diện tích đĩa nuôi.
A B
Ảnh 3.13. Duy trì môi trường nuôi cấy 2 tuần, tế bào trong môi trường biệt hóa tạo thành tấm tế bào gốc trung mô, các tế bào mọc thành hai -3 lớp đan chéo nhau, tấm vật liệu bắt đầu bong (a), bờ mép dịch chuyển về phía trung tâm đĩa (b). (Soi nổi - 50X)
Về khía cạnh mô học, tấm vật liệu có chứa không chỉ tế bào đơn thuần mà còn bao gồm cả đệm gian bào.
Tấm vật liệu cho thấy trong thành phần của chúng chứa rất nhiều tế bào dạng nguyên bào sợi.
A B
Ảnh 3.14. Hình ảnh đại thể tấm vật liệu tương đương trung bì. (a) tấm vật liệu tạo ra sau 2 tuần nuôi cấy tế bào gốc trung mô trong môi trường biệt hóa thành nguyên bào sợi trong, tấm vật liệu dai và dễ tách ra khỏi bề mặt đĩa nuôi cấy. (b) Hình thái cấu trúc trên kính hiển vi quang học nhuộm HE của tấm vật liệu tương đương trung bì, tấm vật liệu có chứa không chỉ tế bào đơn thuần mà còn bao gồm cả đệm gian bào, Tấm vật liệu cho thấy trong thành phần của chúng chứa rất nhiều tế bào dạng nguyên bào sợi và đệm gian bào tương đối dày. (HE, 50X)