thƣơng thực nghiệm
2.3.2.1. Quy trình nghiên cứu thực nghiệm
Sơ đồ 2.1. Thiết kế nghiên cứu vết thƣơng bỏng thực nghiệm
Thỏ nghiên cứu (n = 30) Gây bỏng thực nghiệm 2 bên lƣng thỏ Cắt lọc hoại tử ở vết thƣơng bỏng Vùng B (n = 30) Đắp tấm vật liệu Tegaderm không có tế bào Vùng A (n = 30) Đắp tấm vật liệu tƣơng đƣơng trung bì
Theo dõi diễn biến vết thƣơng bỏng vào các thời điểm D0, D5, D10
Theo dõi diễn biến vết thƣơng bỏng vào các thời điểm D0, D5, D10
Phƣơng pháp nghiên cứu chung là nghiên cứu tiến cứu, theo dõi dọc có đối chứng giữa vùng ghép tế bào và vùng chứng trên cùng một đối tƣợng nghiên cứu.
Tấm tế bào gốc trung mô dây rốn do Khoa Labo nghiên cứu ứng dụng trong điều trị bỏng - Viện Bỏng Quốc Gia Lê Hữu Trác cung cấp. Vật liệu đối chứng là màng che phủ vết thƣơng tegaderm bản chất là polyurenthane hoàn toàn không có tế bào.
Thiết kế nghiên cứu dựa trên quy trình phổ biến điều trị bỏng trên ngƣời hiện nay, cụ thể nhƣ sau:
- Ngày thứ nhất: Gây bỏng thực nghiệm, băng bó vết thƣơng bằng silvirin
- Ngày thứ 2 - 4: Cắt lọc hoại tử sớm, loại bỏ toàn bộ mô hoại tử bỏng,
cầm máu kỹ.
- Ngày thứ 5 (D0): Bắt đầu nghiên cứu ghép tấm vật liệu và thu thập số
liệu nghiên cứu, bao gồm:
+ Đánh giá tình trạng chung: Đánh giá tình trạng toàn thân, cân nặng
thỏ, các xét nghiệm công thức máu, sinh hoá máu, và lấy máu để bảo quản cho việc xác định đáp ứng miễn dịch dịch thể.
+ Đánh giá tại chỗ: Nhận xét tình trạng chung của vết thƣơng, đo kích
thƣớc vết thƣơng, lấy mẫu cấy khuẩn, lấy mẫu mô làm tiêu bản, chụp ảnh nghiên cứu.
- Ngày thứ 10 (D5), ngày thứ 15 (D10), ngày thứ 20 (D15): các thủ
thuật, các kỹ thuật và các công việc lặp lại nhƣ D0.
- Khi vết thƣơng khỏi: Tiếp tục nuôi thỏ để đánh giá tình trạng sẹo. 2.3.2.2. Gây bỏng thực nghiệm
- Phương pháp gây bỏng: Theo phƣơng pháp của Halovec và Pocicado
- Các bước tiến hành:
Thỏ đƣợc cố định vào bàn thí nghiệm chuyên dụng. Cạo sạch lông ở lƣng thành 2 mảng đối xứng, vùng cạo lông hình tròn có đƣờng kính khoảng 10cm để có thể gây vết thƣơng bỏng có diện tích là : r2= 3,14 2,52 = 19,6 cm2.
- Gây mê tĩnh mạch thỏ (Ketamin liều 5mg/1kg cân nặng).
- Dụng cụ gây bỏng bằng bình kim loại hình trụ, đáy tròn có bán kính 2,5cm, cao 25cm (có cán để cầm tay).
Hình 2.2: Dụng cụ gây bỏng thực nghiệm trên thỏ
Đổ nƣớc sôi (t0
= 1000c) vào bình đến độ cao 10cm. Đặt đáy bình vào vùng da đã chuẩn bị, cùng lúc đặt một túi cát nặng 1kg lên miệng bình. Giữ túi cát và cán bình cho thăng bằng, không xê dịch để tạo đƣợc vết bỏng đồng nhất. Thời gian áp đáy bình vào da thỏ là 30 giây để tạo vết bỏng độ IV.
Sau khi gây bỏng, vùng tổn thƣơng có màu trắng đục, da chung quanh vết bỏng xung huyết màu hồng nhạt. Thỏ tỉnh sau vài phút gây bỏng và ăn uống sau vài giờ.
Vị trí gây bỏng: mỗi thỏ gây 2 vết thƣơng bỏng ở vùng lƣng; quy ƣớc là vùng A vết thƣơng bên phải để nghiên cứu ghép tấm vật liệu tƣơng đƣơng trung bì, vùng B vết thƣơng bên trái để đối chứng (đắp tấm Tegaderm không có tế bào).
2.3.2.3.Thay băng chăm sóc vết thƣơng
Thay băng xử lý vết thƣơng đƣợc tiến hành hàng ngày theo quy trình. - Gây mê thỏ bằng Ketamin tiêm bắp thịt liều 5mg/kg trong lƣợng. - Cắt lọc tổ chức hoại tử, lấy bỏ các dị vật, dịch tiết, dịch mủ,… - Rửa vết thƣơng nhiều lần bằng nƣớc muối 0,9% và becberin 1%. - Rửa vết thƣơng bằng Betadine 3%, sát trùng vùng da lành quanh vết thƣơng bằng Betadine 10%, chờ 5 phút, rửa vết thƣơng lần cuối bằng nƣớc muối 0,9% để loại bỏ hoàn toàn dung dịch Betadine ở vết thƣơng.
- Thấm khô vết thƣơng, chụp ảnh nghiên cứu.
- Từ ngày thứ nhất đến ngày thứ năm đắp thuốc chống nhiễm khuẩn Silvirin cả hai vùng A và B.
Từ ngày thứ 5 (D0) ghép tấm tế bào lên vùng A, đắp tấm Tegaderm không có tế bào lên vùng B.
2.3.2.4. Ghép tấm tế bào lên vết thƣơng
Vùng A – vùng nghiên cứu ghép tấm tế bào (quy định vết thƣơng bên phải lƣng thỏ), vùng B – vùng đối chứng (chỉ ghép màng Tegaderm đơn thuần ).
Vùng A:
- Đặt tấm tế bào lên vết thƣơng, tránh để gấp mép, dịch, bọt khí bên dƣới màng, đục một vài lỗ dẫn lƣu dịch. Đặt một lớp gạc vaselin lên trên tấm vật liệu.
- Đặt 5 - 6 lớp gạc vô trùng, băng ép nhẹ.
- Thay băng kỳ đầu sau 24 giờ. Bỏ lớp gạc ngoài, kiểm tra tình trạng bám dính của tấm tế bào, lấy dịch, máu tụ nếu có, đắp gạc vaselin, 5 - 6 lớp gạc thấm.
- Thay băng hàng ngày, nếu tấm vật liệu bám dính, vết thƣơng khô thì để bán hở cho tới khi khỏi.
Vùng B: Xử lý vết thƣơng tƣơng tự vùng A nhƣng tấm màng
Tegaderm che phủ hoàn toàn không có tế bào.
2.3.2.5. Xét nghiệm hình thái cấu trúc mô vết thƣơng
- Sinh thiết mô vết thƣơng bằng dụng cụ sinh thiết (biopsy punch) tại cùng một vị trí của vết thƣơng vào 3 thời điểm:
+ Ngay trƣớc ghép tế bào (D0 - Lần 1) + Ngày nghiên cứu thứ 5 (D5 - Lần 2). +Ngày nghiên cứu thứ 10 (D10 - Lần 3).
- Cố định bệnh phẩm bằng dung dịch Bouin, sau đó chuyển bệnh phẩm vào dung dịnh cồn có nồng độ tăng dần 700, 800, 900, 1000 và xylen 1, xylen 2 trong 3 giờ để đẩy cồn ra khỏi bệnh phẩm. Đúc bệnh phẩm trong parafin nóng chảy ở 560C thành từng bloc riêng và đánh số thứ tự.
- Các bloc đƣợc cắt trên máy Microtome, mỗi lát cắt dầy 5 m. Mỗi bloc cắt 5 tiêu bản, đặt lát cắt lên lam kính sạch và dán bằng nƣớc albumin, để tiêu bản trong tủ ấm 370C trong vòng 12 giờ. Sau đó tẩy parafin bằng xylen 1, xylen 2, tiếp theo dùng cồn 1, và cồn 2 để tẩy xylen.
- Nhuộm hematoxylin – eosin (HE).
- Quan sát tiêu bản dƣới kính hiển vi quang học có độ phóng đại 40 - 400 lần, nhận xét sự biến đổi tế bào và cấu trúc mô. Đếm số lƣợng tế bào viêm (bạch cầu trung tính, đại thực bào, tế bào lympho), nguyên bào sợi, tế bào sợi, mạch máu tân tạo trên một đơn vị diện tích (ĐVDT) dƣới kính hiển vi quang học có gắn vi mét thị kính (1 ĐVDT = 122400m2). Mỗi tiêu bản đếm 4 ĐVDT rồi lấy giá trị trung bình cho từng tiêu bản. Xác định chỉ số phân bào (Mitose Index - MI) bằng cách đếm số lƣợng tế bào phân chia trên
200 tế bào sừng lớp mầm. Xét nghiệm mô học đƣợc tiến hành tại Bộ môn Giải Phẫu Bệnh, Học Viện Quân Y.
2.3.2.6. Xét nghiệm vi khuẩn vết bỏng
- Xét nghiệm vi khuẩn vùng vết thƣơng nghiên cứu và đối chứng để xác định loài và số lƣợng vi khuẩn/cm2
vết thƣơng đựơc tiến hành tại 3 thời điểm: + Ngay trƣớc ghép tế bào (D0 - Lần 1)
+ Ngày nghiên cứu thứ 5 (D5 - Lần 2). + Ngày nghiên cứu thứ 10 (D10 - Lần 3).
- Lấy bệnh phẩm theo phƣơng pháp Ivanov N.A (1984). Đặt miếng phim vô trùng có đục lỗ kích thƣớc 1cm2
lên vết thƣơng bỏng vùng lấy bệnh phẩm. Dùng tăm bông vô trùng nhúng vào nƣớc muối sinh lý 0,9%, sau đó đặt lên vùng đục lỗ 1cm2, lăn nhẹ đầu tăm bông trong 10 giây để lấy bệnh phẩm. Cho tăm bông bệnh phẩm vào ống chứa 5 ml nƣớc muối 0,9%. Lắc nhẹ ống nƣớc muối sinh lý có tăm bông bệnh phẩm trong 15 giây.
- Dùng que cấy định lƣợng 0,01 ml và 0,001 ml đã khử trùng, lấy bệnh phẩm trong nƣớc muối sinh lý, cấy vào hai đĩa môi trƣờng thạch dinh dƣỡng.
- Kỹ thuật cấy: Đầu tiên cấy một đƣờng thẳng theo hết đƣờng kính đĩa thạch, sau đó dàn đều sang hai bên. Để đĩa cấy khuẩn ở tủ ấm 370
trong 24 giờ, sau đó đếm số lƣợng khuẩn lạc có trong đĩa thạch.
- Xác định số lƣợng vi khuẩn có trong 1 cm2 vết bỏng theo công thức: SLVK/ cm2 = (5 N1 x 10
3
) + (5 N2 x 102) 2
N1: Số lƣợng khuẩn lạc ở đĩa thạch cấy lúp 0,001. N2: Số lƣợng khuẩn lạc ở đĩa thạch cấy lúp 0,01. 5: 5 ml nƣớc muối 0,9%.
Bệnh phẩm
Loop 0,001 Loop 0,01 Loop thƣờng Cấy định lƣợng Cấy phân vùng Thạch dinh dƣỡng Thạch dinh dƣỡng Thạch máu
370/24 giờ 370/24 giờ 370/24 giờ
Đếm SLVK Đếm SLVK Xem khuẩn lạc Xác định vi khuẩn.
2.3.2.7. Các chỉ tiêu theo dõi toàn thân
* Toàn thân: Theo dõi khả năng ăn uống, mức độ hoạt động
* Cân nặng thỏ: Đánh giá bằng phƣơng pháp cân tại các thời điểm trƣớc khi gây bỏng, bắt đầu nghiên cứu ghép tế bào (D0 – Lần 1), sau đó cứ 5 ngày cân lại một lần cho đến khi vết thƣơng khỏi.
2.3.2.8. Các chỉ tiêu theo dõi tại chỗ vết thƣơng
Theo dõi hàng ngày diễn biến: Tình trạng sƣng nề, xung huyết; Tình trạng dịch tiết. dịch mủ; Tình trạng dị ứng; Diện tích vết bỏng; Thời gian liền vết thƣơng bỏng; Sự bám dính của tấm vật liệu; Số lần thay tấm vật liệu; Quá trình biểu mô liền vết thƣơng, tính tốc độ biểu mô hoá; Tình trạng của nền tổn thƣơng sau khi khỏi.
Tính diện tích vết thƣơng
Diện tích vết thƣơng đƣợc tính theo cm2. Diện tích vết thƣơng đƣợc đo bằng phƣơng pháp kẻ ô, đặt tấm giấy bóng kính kẻ ô vuông (mỗi ô vuông 1cm2) lên vết thƣơng dùng bút mực vẽ lên tấm giấy bóng kính tƣơng ứng với diện tích vết thƣơng.
t S S
V 1 2
Trong đó:
V : Tốc độ thu hẹp vết thƣơng cm2/ngày.
S1, S2 : Diện tích vết thƣơng ở các thời điểm nghiên cứu (cm2). t : Số tuần ghép nghiên cứu.
Sau đó tính tốc độ liền vết thƣơng theo cm2
/ tuần hoặc tỷ lệ % vết thƣơng liền tại thời điểm đo so với diện tích vết thƣơng ban đầu.
2.3.2.9. Các xét nghiệm huyết học và sinh hoá máu
Máu thỏ đƣợc lấy 4 lần vào các thời điểm: trƣớc khi gây bỏng, ngay trƣớc ghép tấm vật liệu (D0 - Lần 1), ngày nghiên cứu thứ 5 (D5 - Lần 2), ngày nghiên cứu thứ 10 (D10 - Lần 3) để phân tích các chỉ số huyết học và sinh hoá đánh giá chức năng các cơ quan gan và thận…
- Xét nghiệm huyết học: Chỉ tiêu theo dõi gồm có số lƣợng hồng cầu, huyết sắc tố, bạch cầu, công thức bạch cầu trên máy phân tích huyết học tự động.
- Xét nghiệm sinh hoá: Gồm glucose, ure, creatinin trên máy phân tích sinh hóa tự động.
2.3.2.10. Xác định hoạt độ enzym GOT trong huyết thanh
Nguyên lý: Aspartat Aminotransferase (AST/GOT ) xúc tác chuyển nhóm amin từ L-aspartate sang 2-oxoglutarate để tạo thành oxaloacetate và L- glutamate. Maleat dehydrogennase (MDH) xúc tác khử oxaloactate và oxy hoá NADH thành NAD. Lƣợng NAD tiêu thụ sẽ làm giảm độ hấp thụ và tỷ lệ với hoạt độ của enzym AST/GOT.
Đo hoạt độ GOT theo phƣơng pháp động học ở bƣớc sóng 340nm, nhiệt độ 370C, đơn vị là U/L.
2.3.2.11. Xác định hoạt độ enzym GPT trong huyết thanh
Nguyên lý: Alanin Aminotransferase (AST/GOT ) xúc tác chuyển nhóm amin từ L-alanin sang 2-oxoglutarate để tạo thành pyruvat và glutamate. Lactatdehydrogenase (LDH) xúc tác sự khử của pyruvat và oxy hoá của NADH tạo thành NAD+. Sự giảm NADH làm giảm độ hấp thụ và tỷ lệ với hoạt độ của ALT/GPT.
Đo hoạt độ GOT theo phƣơng pháp động học ở bƣớc sóng 340 nm, nhiệt độ 370
C.