3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
3.2.4. Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5
Chúng tôi sử dụng vector tách dòng là pBT để tiến hành phản ứng ghép nối và biến nạp.
Sản phẩm thôi gel đƣợc gắn vào vector pBT bởi enzyme T4 ligase. Phản ứng ghép nối dựa trên nguyên tắc bổ sung giữa 2 đầu nucleotide A thò ra ở sản phẩm PCR với Taq polymerase và 2 đầu nucleotide T ở vector tách
dòng. Hỗn hợp phản ứng đƣợc ủ ở nhiệt độ phòng 280
C trong 2 giờ để phản ứng xảy ra hoàn toàn. Vector tái tổ hợp sau đó đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E.coli chủng DH5 và đƣợc cấy trải trên môi trƣờng LB đặc có bổ sung ampicillin 100mg/l, X-gal 0,004% và IPTG 100µM. Ủ đĩa petri ở 370C trong 16 giờ.
Thành công của thí nghiệm phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố, nhƣng có 2 yếu tố quan trọng nhất: (i) sản phẩm PCR phải đặc hiệu, chất lƣợng tốt; (ii) tế bào khả biến phải đƣợc chuẩn bị tốt mới đạt đƣợc hiệu suất biến nạp cao nhất.
Hình 3.4: Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến
E.coli DH5
Trên hình 3.4 cho thấy kết quả biến nạp tốt, chúng tôi đã thu đƣợc một lƣợng lớn các khuẩn lạc. Các khuẩn lạc xanh có thể mọc lên từ các tế bào nhận đƣợc plasmid tự đóng vòng trở lại nên gen lac-operon hoạt động tổng hợp enzyme β-galactosidase. Enzym này sẽ chuyển hóa cơ chất X-gal thành hợp chất có màu xanh dƣới sự cảm ứng của IPTG. Còn những khuẩn lạc trắng xuất hiện là do vi khuẩn nhận đƣợc plasmid mang lac-operon không hoạt
động, enzyme β-galactosidase không đƣợc tạo ra nên không có quá trình chuyển hóa X-gal thành dạng màu xanh. Lac-operon bị bất hoạt có thể do đoạn gen ngoại lai xen vào giữa promoter của operon gen lac Z làm cho lac- promotor không thể điều khiển quá trình tổng hợp enzyme. Đoạn gen ngoại lai có thể là đoạn gen CP-SMV nguyên vẹn hoặc cũng có thể là những đoạn bị đứt gãy. Các khuẩn lạc trắng có thể là những khuẩn lạc vệ tinh không mang plasmid. Khuẩn lạc vệ tinh có kích thƣớc nhỏ, đƣợc mọc lên xung quanh các khuẩn lạc có plasmid chứa đoạn gen xen vào sau khi khuẩn lạc này đã phân hủy đáng kể lƣợng kháng sinh trong môi trƣờng xung quanh.
Để chọn đƣợc dòng tế bào mang plasmid tái tổ hợp chứa đoạn gen CP cần phải tiến hành chọn plasmid tái tổ hợp bằng cách PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR) với cặp mồi SMVcp-F và SMVcp-R để tế bào E.coli mang đoạn gen CP, kết quả đƣợc trình bày ở hình 3.5.
Hình 3.5. Hình ảnh điện di sản phẩm colony- PCR từ khuẩn lạc
(M: thang DNA chuẩn 1 kb; 1, 2, 3, 4, 5, 6: gen CP khuếch đại từ khuẩn lạc)
Hình 3.5 cho thấy kết quả điện di thu đƣợc một băng DNA duy nhất có kích thƣớc khoảng 0,7kb, là kích thƣớc của đoạn gen CP.
3.2.5. Kết quả tách plasmid từ các khuẩn lạc của các mẫu nghiên cứu
Chọn 4 mẫu khuẩn lạc trắng (đã đƣợc nuôi lắc 20 vòng/phút trong 3ml môi trƣờng LB lỏng ở 370C qua đêm) có sản phẩm colony- PCR mong muốn để tách plasmid theo Sambrook và đtg (2001).
Kết quả điện di ở hình 3.6 cho thấy, sản phẩm tách plasmid sạch, đảm bảo chất lƣợng và số lƣợng phục vụ cho việc xác định trình tự nucleotide của đoạn gen CP
Hình 3.6. Hình ảnh điện di sản phẩm tách plasmid tái tổ hợp mang đoạn gen CP