3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
3.2.2. Kết quả nhân gen CP
cDNA đƣợc tạo ra từ mRNA bằng phiên mã ngƣợc trong 20 l dung dịch có chứa 5 l RNA tổng số; 1 l mồi ngẫu nhiên; bổ sung nƣớc khử ion tới thể tích 12 l. Dung dịch phản ứng này đƣợc ủ ở nhiệt độ 650C trong 5 phút, sau đó giữ ở nhiệt độ 4oC. Tiếp theo bổ sung 4 l 5X đệm RT tổng hợp cDNA; 1 l chất ức chế ribonuclease tái tổ hợp RNase Inhibitor (20 đơn vị/ l); 2 l 10mM dNTP Mix; 1 l RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase (200u/ l) vào dung dịch trên trƣớc khi thực hiện chu kỳ nhiệt nhƣ sau: 1 chu kỳ 420
C trong 60 phút, 1 chu kỳ 700
C trong 5 phút và giữ ở 40C.
Để khẳng định RNA của virus có trong RNA tổng số vừa tách đƣợc hay không chúng tôi tiến hành phản ứng RT-PCR với cặp mồi đặc hiệu đã thiết kế. Dựa vào kết quả so sánh 96 trình tự gen CP bằng chƣơng trình BLAST trong NCBI cho thấy các trình tự tƣơng đồng từ 94% đến 100% và đoạn bảo thủ của gen CP đƣợc xác định đƣợc có số lƣợng nucleotide khoảng hơn 750bp (Hình 3.2). Từ kết quả so sánh xác định vùng tƣơng đồng của các trình tự gen CP chúng tôi đã thiết kế cặp mồi để nhân đoạn gen CP từ virus SMV dự tính kích thƣớc là: 700bp < Đoạn gen CP<750bp. Trình tự cặp mồi đƣợc thiết kế có trình tự đƣợc thể hiện ở bảng 3.1.
Hình 3.2. Kết quả xác định đoạn tƣơng đồng của 96 trình tự gen CP khi so sánh bằng BLAST trong NCBI
Bảng 3.1. Trình tự cặp mồi PCR nhân đoạn gen CP
Mồi Trình tự
SMVcp-F 5’-TTACCATCAGGCAAGGAGCAGGAAG -3’ SMVcp-R 5’-TGGACTTGATGGGAACATCTCAACT -3’
Phản ứng PCR nhân bản đoạn mã hóa của gen CP đƣợc thực hiện để khuếch đại đoạn cDNA với cặp mồi đã thiết kế SMVcp-F/SMVcp-R. Nhiệt độ gắn mồi khả dụng cho phản ứng PCR là 570
C, sau 35 chu kỳ phản ứng. Nếu phản ứng xảy ra đặc hiệu, theo lý thuyết sẽ xuất hiện một băng DNA có kích thƣớc khoảng 0,7kb.
Kết quả kiểm tra sản phẩm RT-PCR bằng điện di trên gel argarose 1% đƣợc thể hiện ở hình 3.3.
Hình 3.3. Ảnh điện di sản phẩm RT - PCR khuếch đại đoạn gen CP của SMV (1-SL1, 2- SL2, M: Thang DNA chuẩn 1 kb)
Kết quả RT-PCR trên hình cho thấy, đã nhân đƣợc đoạn gen có kích thƣớc khoảng 0,7kb. Kết quả này phù hợp với giả thiết của chúng tôi khi sử dụng cặp mồi SMVcp-F /SMVcp-R. Hàm lƣợng sản phảm RT-PCR đủ cho các thao tác thí nghiệm tiếp theo. Chúng tôi kết luận đã nhân bản thành công đoạn gen có kích thƣớc tƣơng ứng với đoạn gen CP của virus SMV trên đậu
0,5kb 0,1kb 2,0kb
0,7kb
tƣơng. Để có thể khẳng định đoạn gen CP đã phân lập chúng tôi tách dòng và xác định trình tự đoạn gen CP của SMV.