3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Phƣơng pháp thu mẫu
Dụng cụ thu mẫu bao gồm: túi polyetylen cỡ lớn dùng để đựng mẫu, kéo cắt cây, giấy báo, nhãn, dập ghim, cồn khử trùng, sổ ghi chép, băng dính các loại, máy ảnh...
Phƣơng pháp thu mẫu đƣợc thực hiện nhƣ sau: Để thu mẫu hiện nay ngƣời ta dùng túi polyetylen để đựng mẫu mà không dùng cặp gỗ dán nhƣ trƣớc đây vì vừa cồng kềnh vừa khó bảo quản. Sau khi quan sát thấy cây có dấu hiệu nghi nhiệm bệnh, chúng tôi tiến hành nhổ cả cây cho vào túi polyetylen cỡ lớn, dập ghim lại và bọc bằng giấy báo. Ghi lại đặc điểm, màu sắc, dấu hiệu bệnh của cây đó và dán lên túi polyetylen. Cây sau khi nhổ lên phải nhanh chóng đƣa về phòng thí nghiệm để xử lý, không đƣợc để quá 12 tiếng.
Mẫu sau khi thu đƣợc đƣa về phòng thí nghiệm khử trùng bằng cồn, chúng tôi dùng kéo đã khử trùng cắt lấy những lá có khả năng nhiễm bệnh cao cho vào túi polyetylen nhỏ. Dán nhãn, ghi lại đặc điểm mẫu của từng vùng. Sau đó, bảo quản mẫu ở tủ -300
C.
2.2.2. Các phƣơng pháp sinh học phân tử 2.2.2.1. Phƣơng pháp tách chiết RNA
Phƣơng pháp tách chiết RNA tổng số: Sử dụng bộ kit GeneJET Plant RNA Purification Mini Kit (Hãng Thermo Scientific) để tách chiết RNA tổng số từ các mẫu lá đậu tƣơng theo chỉ dẫn của nhà sản xuất gồm các bƣớc:
1) Nghiền nhanh 100mg mẫu trong nitơ lỏng.
2) Hút 500 µl Plant RNA Lysis Solution, thêm 10 µl DTT 2M cho vào ống 1,5 ml
3) Ủ trong 3 phút, 560C sau đó li tâm 5 phút 20.000g (14.000rpm) 4) Thu dịch nổi (khoảng 450 – 550 µl) chuyển vào ống sạch 5) Thêm 250 µl cồn 96%, trộn đều
6) Chuyển hỗn hợp sang cột lọc, li tâm 1 phút 12.000g (11.000rpm), sau đó loại bỏ dịch trong ống
7) Thêm 700 µl Wash Buffer WB1 vào cột lọc (cần đảm bảo rằng WB1 đã đƣợc bổ sung cồn)
8) Li tâm 1 phút 12.000g (11.000rpm), loại bỏ dịch trong ống sau đó chuyển cột sang ống 2 ml
9) Thêm 500 µl Wash Buffer WB2 vào cột lọc (cần đảm bảo rằng WB2 đã đƣợc bổ sung cồn)
10) Li tâm 1 phút 12.000g (11.000rpm), sau đó loại bỏ dịch trong ống 11) Cho tiếp 500 µl Wash Buffer WB2 vào cột lọc
12) Sau đó li tâm nhanh 1 phút 20.000g (14.000rpm) , loại bỏ dịch và chuyển cột sang ống 1,5ml
13) Tách RNA ra khỏi màng bằng cách thêm 50 µl H2O vào đúng giữa màng, để 1 phút tại nhiệt độ phòng, sau đó li tâm 1 phút, 11000 vòng. 14) Bảo quản RNA ở - 200C. Giữ RNA trên đá trƣớc và trong khi tiến hành
thí nghiệm.
15) Kiểm tra sản phẩm RNA tổng số tách chiết đƣợc bằng điện di trên gel agarose 1%.
2.2.2.2. Phƣơng pháp tổng hợp cDNA
cDNA đƣợc tổng hợp từ RNA tổng số, các thành phần cho phản ứng tổng hợp cDNA đƣợc trình bày theo bảng sau:
Bảng 2.1. Thành phần cho phản ứng tổng hợp cDNA STT Thành phần Thể tích 1 RNA tổng số 5 µl 2 Oligo (dT) primer 1 µl 3 H2O 6 µl Tổng thể tích 12 µl
- Ủ ở 650C/5 phút sau đó cho ngay vào đá lạnh. - Thêm các thành phần sau theo thứ tự :
4 5X Reaction Buffer 4 µl 5 RiboLock RNase Inhibitor (20u/ µl) 1 µl
6 10 mM dNTP Mix 2 µl
7 RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase (200u/ µl)
1 µl
- Li tâm nhanh
- Cho vào máy PCR ủ theo chu trình nhiệt : 420C/60 phút; 700C/5 phút. - Sản phẩm cDNA có thể sử dụng trực tiếp, giữ ở -200C trong 1 tuần
hoặc giữ lâu hơn ở -700C.
2.2.2.3. Phƣơng pháp PCR
Gen CP đƣợc khuếch đại từ cDNA bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu đƣợc thiết kế dựa trên trình từ của gen CP có mã số trên Ngân hàng gen quốc tế là X63771, ký hiệu cặp mồi là SMVcp-F/SMVcp-R.
Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt của phản ứng PCR đƣợc trình bày ở Bảng 2.2 và Bảng 2.3.
Bảng 2.2.Thành phần của phản ứng PCR nhân gen CP
STT Thành phần Nồng độ
1 Nƣớc khử ion 8,6µl
2 Master Mix 12.5µl
3 Mồi xuôi (10pmol/µl) 0,7µl
4 Mồi ngƣợc (10pmol/µl) 0,7µl
5 cDNA khuôn 2,5µl
Bảng 2.3. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR nhân gen CP
Phản ứng Nhiệt độ (0C) Thời gian Chu kỳ
Biến tính 94 3 phút 1
Biến tính 94 1 phút
35
Gắn mồi 57 45 giây
Kéo dài chuỗi 72 45giây
Hoàn tất kéo dài 72 5 phút 1 Kết thúc phản ứng 4 ∞
2.2.2.4. Phƣơng pháp tinh sạch sản phẩm PCR
- Quá trình tinh sạch đƣợc thực hiện theo quy trình và bộ hóa chất sử dụng cho tinh sạch của hãng QIAGEN (QIAquick DNA Gel Extraction Kit), gồm các bƣớc sau:
1. Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1 % và cắt lấy băng quan tâm 2. Bổ sung dung dịch QG theo tỷ lệ : Vmẫu : VQG = 1: 3 (1 µl tƣơng đƣơng với
1 mg mẫu) 3. Ủ ở 500
C trong 15 phút, 3 phút trộn nhẹ một lần, sau khi gel tan hết ủ thêm 5 phút cho gel tan hoàn toàn
4. Chuyển hỗn hợp dung dịch lên cột thôi gel QIAquick spin column, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ dịch chảy qua cột.
5. Bổ sung 500 µl dung dịch QG, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ dịch chảy qua cột
7. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch chảy qua cột, ly tâm bổ sung 1 phút để loại hết PE
8. Hòa tan DNA trong 30 – 50 µl H2O deion khử trùng, đã đƣợc làm ấm đến 500C để ở nhiệt độ phòng 1 phút sau đó ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút.
2.2.2.5. Phƣơng pháp ghép nối đoạn gen CP vào vector pBT
Vector pBT có cấu tạo nhƣ hình 2.1 và thành phần gắn vector đƣợc trình bày ở bảng 2.4
Bảng 2.4. Thành phần phản ứng ghép nối gen CP vào vector tách dòng pBT STT Thành phần Thể tích 1 CP ( 10 – 20 ng/µl) 7 µl 2 Ligation buffer 10X 1 µl 3 Vector pBT 1 µl 4 T4 ligase 1 µl 5 Tổng 10 µl
Bổ sung lần lƣợt các thành phần của phản ứng vào ống eppendorf 0,5 ml, ủ ở 220C trong 3 giờ.
Biến nạp sản phẩm ghép nối vào E.coli DH5α bằng phƣơng pháp sốc nhiệt.
Cấy trải 100 µl dịch biến nạp trên môi trƣờng chứa kháng sinh chọn lọc (carbenicillin).
Ủ qua đêm ở 370
C.
2.2.2.6. Phƣơng pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony – PCR)
Chọn dòng tế bào chứa vector tái tổ hợp đƣợc thực hiện bằng phƣơng pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony – PCR), thành phần phản ứng colony – PCR đƣợc trình bày ở Bảng 2.5 và chu trình nhiệt của phản ứng đƣợc trình bày ở Bảng 2.6.
Bảng 2.5.Thành phần phản ứng colony – PCR STT Thành phần Thể tích 1 Nƣớc khử ion 13µl 2 Đệm PCR 10X 2,5µl 3 MgCl2 ( 25mM) 2µl 4 dNTPs ( 10mM) 2,5µl
5 Mồi xuôi (10pmol/µl) 1µl 6 Mồi ngƣợc (10pmol/µl) 1µl 7 Taq DNA polymerase (5 đơn vị/µl) 1µl
8 cDNA khuôn 2µl
Tổng thể tích phản ứng 25µl
Bảng 2.6. Chu trình nhiệt của phản ứng colony – PCR
Phản ứng Nhiệt độ (0C) Thời gian Chu kỳ
Biến tính 94 5 phút 1 Biến tính 94 1 phút
30 Gắn mồi 57 1 phút
Kéo dài chuỗi 72 1 phút
Hoàn tất kéo dài 72 10 phút 1 Kết thúc phản ứng 4 ∞
2.2.2.7. Phƣơng pháp tách chiết plasmid
Phƣơng pháp tách chiết plasmid tái tổ hợp đƣợc thực hiện theo Sambrook và đtg (2001) và thành phần hóa chất tách chiết đƣợc trình bày ở bảng 2.7.
Bảng 2.7. Thành phần hóa chất tách chiết plasmid
STT Thành phần
Sol I 50 mM glucose, 25 mM Tris HCl pH 8, 10 mM EDTA pH 8
Sol II 0,2 NaOH, SDS 1 %
Sol III 60 ml potassium acetate 5M; 11,5 ml glacial acetic acid; 28,5 ml H2O
Các bước tiến hành tách plasmid:
1. Lấy 10 ml dung dịch vi khuẩn nuôi trong LB lỏng 12 - 16 giờ.
2. Ly tâm 8000 v/p thu tế bào, có thể lặp lại 5 lần để thu hết cặn khuẩn của 10 ml dịch khuẩn.
3. Bổ sung 200 µl Sol I hòa tan tế bào hoàn toàn. 4. Bổ sung 400 µl Sol II trọn nhẹ trong 30 giây. 5. Bổ sung tiếp 300 µl Sol III trộn nhẹ trong 30 giây.
6. Bổ sung 900 µl chloroform : isoamin (24 : 1) trộn đều trong 3 phút. 7. Ly tâm 13000v/p, hút nhẹ nhàng không cặn 900µl pha trên sang ống
effendorf mới.
8. Cho 900 µl isopropanol 100% để ở nhiệt độ -4o
C trong 30 – 180 phút, ly tâm 13000 v/p, loại bỏ phần dịch lỏng, thu cặn.
9. Cho 500 µl cồn 70% vào, ly tâm 7000 v/p trong 5 phút, sau đó loại bỏ cồn và làm đông khô trong 30 phút.
10. Hòa tan sản phẩm trong 50 µl nƣớc khử ion. 11. Bổ sung RNase
12. Ủ ở 370
C trong 30 phút.
Kiểm tra sản phẩm tách plasmid bằng điện di trên gel agarose 0,8%.
2.2.2.8. Phƣơng pháp xác định trình tự nucleotide của gen
Trình tự của gen đƣợc xác định trên máy đọc trình tự nucleotide tự động ABI PRISM@
3100 Advant Genetic Analyzer (Applied Biosystem) sử dụng bộ hoá chất sinh chuẩn BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing.
2.2.3. Phƣơng pháp phân tích xử lý trình tự gen
Sử dụng phần mềm DNAstar, BLAST và BioEdit để phân tích, so sánh trình tự gen CP, quy trình so sánh và xử lý trình tự gen CP đƣợc tiến hành theo trình tự sau:
1. So sánh trình tự đoạn gen CP của dòng virus SL với các trình tự gen CP trong BLAST của NCBI để xác định gen đƣợc tách dòng là của SMV. 2. So sánh trình tự đoạn gen CP của dòng SL với trình tự trên GenBank. 3. Giải mã trình tự nucleotide sang trình tự amino acid và so sánh với
trình tự đã công bố.
4. Lập cây phân loại và bảng hệ số đồng dạng so sánh mức độ tƣơng đồng di truyền.
Chƣơng 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. KẾT QUẢ THU MẪU LÁ ĐẬU TƢƠNG NHIỄM BỆNH Ở MỘT SỐ ĐỊA PHƢƠNG MIỀN BẮC VIỆT NAM SỐ ĐỊA PHƢƠNG MIỀN BẮC VIỆT NAM
Chúng tôi tiến hành thu mẫu lá nghi nhiễm bệnh virus SMV tại một số tỉnh nhƣ Thái Nguyên, Sơn La, Tuyên Quang và Hà Nội, kết quả thu đƣợc các mẫu lá nghi nhiễm virus SMV trình bày ở hình 3.1.
Hình 3.1. Các mẫu lá đậu tƣơng nghi nhiễm bệnh thu thập ở các tỉnh Thái Nguyên, Sơn La, Tuyên Quang, Hà Nội
A. Thái Nguyên, B. Sơn La, C. Tuyên Quang; D. Hà Nội
A B
C
Hình 3.1 cho thấy: Lá to, tròn, có màu vàng, lá hơi xoăn, phiến lá dày (hình 3.1A). Lá xanh, hình bầu dục, phiến lá mỏng, có rệp bám kín 2 mặt lá và trên thân (hình 3.1B). Lá to, phiến lá dày, lá có màu xanh đậm, lá xoăn (hình 3.1C). Lá nhỏ, dài, bề mặt lá xoăn có màu vàng loang lổ (hình 3.1D).
Các mẫu lá thu về chúng tôi khử trùng bằng cồn, sau đó cho vào túi polyetylen và bảo quản ở -300C.
Nhƣ vậy chúng tôi thu đƣợc mẫu lá ở bốn địa phƣơng bao gồm Thái Nguyên (TN), Sơn La (SL), Tuyên Quang (TQ), Hà Nội (HN).
3.2. KHUẾCH ĐẠI, TÁCH DÒNG VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ ĐOẠN GEN CP TỪ HỆ GEN CỦA VIRUS SMV GEN CP TỪ HỆ GEN CỦA VIRUS SMV
3.2.1. Tách chiết RNA tổng số
Chúng tôi lấy phần gân lá và những lá có rệp bám vào làm nguyên liệu và sử dụng bộ kit GeneJET Plant RNA Purification Mini Kit (của hãng Thermo Scientific) để tách chiết RNA tổng số. Kết quả cho thấy RNA tổng số thu đƣợc có hàm lƣợng cao, chất lƣợng tốt, đảm bảo cho việc tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
Khác với DNA, RNA là loại phân tử không bền, dễ bị thủy phân bởi các ribonuclease (RNase). Hơn nữa các RNase lại có mặt ở khắp nơi, hoạt tính mạnh và rất bền, vì thế việc tách chiết RNase đòi hỏi thao tác thật cẩn thận để tránh mọi tạp nhiễm chứa RNase từ môi trƣờng, tất cả các dụng cụ phải đƣợc xử lý trƣớc khi tiến hành thí nghiệm: cối chày sứ đƣợc xử lý ở 2000C trong 3 giờ, các dụng cụ khác đƣợc xử lý trong DEPC 0,1%.
Trong quá trình tách chiết, việc nghiền mẫu trong nitơ lỏng để phá vỡ thành tế bào và giải phóng các thành phần trong tế bào đòi hỏi thao tác phải nhanh. Sau khi mẫu đã đƣợc nghiền mịn cần bổ sung ngay Plant RNA Lysis
Solution cùng với DTT 2M. Nếu không nuclease nội bào đƣợc giải phóng sẽ thủy phân RNA. Sản phẩm RNA tổng số đƣợc hòa tan trong nƣớc 0,1 % DEPC có tác dụng ngăn cản RNase thủy phân RNA.
3.2.2. Kết quả nhân gen CP
cDNA đƣợc tạo ra từ mRNA bằng phiên mã ngƣợc trong 20 l dung dịch có chứa 5 l RNA tổng số; 1 l mồi ngẫu nhiên; bổ sung nƣớc khử ion tới thể tích 12 l. Dung dịch phản ứng này đƣợc ủ ở nhiệt độ 650C trong 5 phút, sau đó giữ ở nhiệt độ 4oC. Tiếp theo bổ sung 4 l 5X đệm RT tổng hợp cDNA; 1 l chất ức chế ribonuclease tái tổ hợp RNase Inhibitor (20 đơn vị/ l); 2 l 10mM dNTP Mix; 1 l RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase (200u/ l) vào dung dịch trên trƣớc khi thực hiện chu kỳ nhiệt nhƣ sau: 1 chu kỳ 420
C trong 60 phút, 1 chu kỳ 700
C trong 5 phút và giữ ở 40C.
Để khẳng định RNA của virus có trong RNA tổng số vừa tách đƣợc hay không chúng tôi tiến hành phản ứng RT-PCR với cặp mồi đặc hiệu đã thiết kế. Dựa vào kết quả so sánh 96 trình tự gen CP bằng chƣơng trình BLAST trong NCBI cho thấy các trình tự tƣơng đồng từ 94% đến 100% và đoạn bảo thủ của gen CP đƣợc xác định đƣợc có số lƣợng nucleotide khoảng hơn 750bp (Hình 3.2). Từ kết quả so sánh xác định vùng tƣơng đồng của các trình tự gen CP chúng tôi đã thiết kế cặp mồi để nhân đoạn gen CP từ virus SMV dự tính kích thƣớc là: 700bp < Đoạn gen CP<750bp. Trình tự cặp mồi đƣợc thiết kế có trình tự đƣợc thể hiện ở bảng 3.1.
Hình 3.2. Kết quả xác định đoạn tƣơng đồng của 96 trình tự gen CP khi so sánh bằng BLAST trong NCBI
Bảng 3.1. Trình tự cặp mồi PCR nhân đoạn gen CP
Mồi Trình tự
SMVcp-F 5’-TTACCATCAGGCAAGGAGCAGGAAG -3’ SMVcp-R 5’-TGGACTTGATGGGAACATCTCAACT -3’
Phản ứng PCR nhân bản đoạn mã hóa của gen CP đƣợc thực hiện để khuếch đại đoạn cDNA với cặp mồi đã thiết kế SMVcp-F/SMVcp-R. Nhiệt độ gắn mồi khả dụng cho phản ứng PCR là 570
C, sau 35 chu kỳ phản ứng. Nếu phản ứng xảy ra đặc hiệu, theo lý thuyết sẽ xuất hiện một băng DNA có kích thƣớc khoảng 0,7kb.
Kết quả kiểm tra sản phẩm RT-PCR bằng điện di trên gel argarose 1% đƣợc thể hiện ở hình 3.3.
Hình 3.3. Ảnh điện di sản phẩm RT - PCR khuếch đại đoạn gen CP của SMV (1-SL1, 2- SL2, M: Thang DNA chuẩn 1 kb)
Kết quả RT-PCR trên hình cho thấy, đã nhân đƣợc đoạn gen có kích thƣớc khoảng 0,7kb. Kết quả này phù hợp với giả thiết của chúng tôi khi sử dụng cặp mồi SMVcp-F /SMVcp-R. Hàm lƣợng sản phảm RT-PCR đủ cho các thao tác thí nghiệm tiếp theo. Chúng tôi kết luận đã nhân bản thành công đoạn gen có kích thƣớc tƣơng ứng với đoạn gen CP của virus SMV trên đậu
0,5kb 0,1kb 2,0kb
0,7kb
tƣơng. Để có thể khẳng định đoạn gen CP đã phân lập chúng tôi tách dòng và xác định trình tự đoạn gen CP của SMV.
3.2.3. Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR
Quá trình tách dòng đƣợc thực hiện bằng cách gắn sản phẩm PCR và vector tách dòng. Tuy nhiên, sản phẩm PCR ngoài đoạn gen mong muốn ra còn rất nhiều sản phẩm phụ, các nucleotide dƣ thừa sau phản ứng, mồi, enzyme, đệm… Vì thế, để phản ứng ghép nối đạt hiệu quả cao nhất cần thiết phải có quá trình tinh sạch sản phẩm PCR để loại bỏ các thành phần không mong muốn. Qui trình tinh sạch sản phẩm PCR (thôi gel) đƣợc thực hiện theo hƣớng dẫn của bộ kit QIAquick Gel Extraction.
Khi nâng nhiệt độ lên 500C thì agarose tan chảy, DNA đƣợc hòa vào dung dịch QG. Sau khi cho dung dịch và cột tinh sạch QIAquick spin, DNA đƣợc giữ lại bởi các phân tử có ái lực cao với DNA cố định trên màng lọc của cột tinh sạch, dịch đệm QG và agarose bị loại đi nhờ li tâm. Để loại bỏ hết agarose còn bám trên màng lọc, cần thiết phải bổ sung QG và cột lần thứ 2.