5. Thời gian
1.7.Vaccine cúm gia cầm
Các nghiên cứu cho thấy chỉ có đáp ứng miễn dịch chống lại protein Haemaglutinin (HA) có tác dụng chống lại bệnh, còn các đáp ứng miễn dịch kháng lại protein bên trong như Nucleoprotein (NP) và protein Matrix (M) của virus đã được chứng minh là không đủ để tạo phòng hộ trên thực địa. Vì vậy không có 1 vaccine nào chung cho tất cả các virus cúm gia cầm. Trong thực tế sự phòng hộ được tạo ra nhờ các subtyp Haemaglutinin có trong vaccine [29].
* Tác dụng của Vaccine:
- Giảm các triệu chứng lâm sàng và chết.
- Giảm bài thải virus cường độc nếu gia cầm bị nhiễm virus đó (trên > 1000 lần) so với gia cầm không được tiêm, ngừng hẳn sự bài thải virus vào ngày 13 -18 sau tiêm.
- Phòng được sự lây lan virus cường độc do tiếp xúc.
- Phòng hộ chống lại công cường độc bằng virus thực địa dù liều gây nhiễm cao hay thấp.
- Phòng hộ chống lại virus luôn thay đổi.
- Tăng sức đề kháng của gà chống lại nhiễm virus cúm gia cầm [1, 16, 28].
* Các loại vaccine phòng bệnh hiện nay:
- Vaccine vô hoạt đồng chủng: Ban đầu được sản xuất như các vaccine tự phát (autogenous), nghĩa là vaccine chứa cùng những virus cúm giống như chủng gây bệnh trên thực địa. Loại vaccine này được sử dụng rộng rãi ở Mehico và Pakistan [16, 46]. Nhược điểm của vaccine này là không phân biệt gia cầm được tiêm chủng với gia cầm nhiễm virus thực địa qua kiểm tra kháng thể.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
- Vaccine vô hoạt dị chủng: vaccine này được sản xuất tương tự như vaccine vô hoạt đồng chủng. Điểm khác biệt là chủng virus sử dụng trong vaccine có kháng nguyên H giống chủng virus trên thực địa còn kháng nguyên N dị chủng. Khi nhiễm virus trên thực địa bảo hộ lâm sàng và giảm thải trừ virus ra ngoài môi trường được đảm bảo bằng phản ứng miễm dịch sản sinh bởi kháng nguyên nhóm H đồng chủng, trong khi kháng thể chống N sản sinh bởi virus thực địa có thể sử dụng như chất đánh dấu sự lây nhiễm trên thực địa [16, 34].
Đối với vaccine dị chủng, mức độ bảo hộ không tỷ lệ chặt chẽ với mức độ đồng chủng giữa gen ngưng kết tố hồng cầu trong vaccine và chủng trên thực địa [51]. Đây là một ưu điểm lớn cho phép thành lập ngân hàng vaccine bởi vì giống gốc không chứa virus có mặt trên thực địa.
- Vaccine tái tổ hợp: Một vài loại vaccine tái tổ hợp virus đậu gà chứa kháng nguyên H5, H7 đã được sử dụng, ở đây virus đậu gà được sử dụng như một vecter dẫn truyền. Ngoài ra người ta cũng đã sử dụng virus viêm thanh khí quản truyền nhiễm làm vecter dẫn truyền [43].
Các nhà khoa học thuộc Viện nghiên cứu Cáp Nhĩ Tân đã sản xuất thành công vaccine tái tổ hợp phòng chóng cúm gia cầm và Niucatxơn, vaccine có thể dùng theo đường tiêm, đường miệng, đường mũi hoặc theo phương pháp khí dung. Đến cuối tháng 12/2005 Trung quốc đã sản xuất được một tỉ liều [29]. Sử dụng vaccine tái tổ hợp có vecter dẫn truyền cho phép phân biệt được con vật nhiễm bệnh tự nhiên và con vật được tiêm chủng.
Trước khi sử dụng một loại vaccine mới trên diện rộng, cần đánh giá tính an toàn ở con vật được dùng vaccine, vấn đề an toàn của môi trường, độ tinh khiết và hiệu lực của vaccine [29].
* Khuyến cáo của OIE về việc sử dụng vaccine phòng chống cúm gia cầm
Đối với bệnh cúm gà, việc sử dụng, tiêm chủng vaccine như một giải pháp, một công cụ hỗ trợ tích cực để ngăn chặn, khống chế và tiến đến thanh
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
toán bệnh cúm gà ở vùng nhiễm bệnh [21]. Theo quan điểm của OIE , FAO, WHO [32, 19, 39], vaccine nên được sử dụng như là một biện pháp trong chiến lược toàn diện phòng chống bệnh cúm gia cầm mà chiến lược đó bao gồm:
+ An toàn sinh học.
+ Nâng cao nhận thức người dân. + Chẩn đoán và giám sát.
+ Loại bỏ gia cầm bị nhiễm virus. + Sử dụng vaccine.
* Lưu ý trước khi sử dụng vaccine
- Vaccine phải cùng subtype Hemagglutinin và phải được chứng minh trên bản động vật là có đủ khả năng bảo hộ chống lại sự xâm nhập của virus thực địa.
- Vaccine phải được sản xuất theo công nghệ đã tiêu chuẩn hóa để đảm bảo có một vaccine hiệu quả và phù hợp về chủng virus.
- Cần có các hoặch định trước về bảo quản tốt vaccine, phân phối và sử dụng vaccine.
- Đảm bảo được việc giám sát huyết thanh học, virus học để xác định virus cường độc có lưu hành trong đàn gia cầm được dùng vaccine hay không. - Phải có một kế hoạch loại trừ để phòng tránh việc sử dụng vĩnh viễn vaccine.
* Ưu điểm của tiêm chủng
- Giảm đáng kể virus bài xuất trong đàn gà nhiễm bệnh.
- Giảm thiểu nhu cầu loại thải những đàn gia cầm khoẻ mạnh. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Là phương án thay thế khả thi đối với những đàn gà có giá trị cao và gà chăn nuôi gia đình, gà cảnh.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
* Nhược điểm của việc tiêm chủng
- Không phù hợp với qui định thương mại quốc tế. Tiêm chủng được chấp nhận như một biện pháp khống chế dịch cúm gà của OIE [32].
- Những đàn gà tiêm chủng không biểu hiện triệu chứng lâm sàng bệnh cúm.
1.8. NGHIÊN CỨU TRONG NƢỚC VỀ BỆNH CÚM GIA CẦM
Trước diễn biến hết sức phức tạp của bệnh cúm gia cầm, Viện Thú y Quốc gia đã kết hợp với Trung tâm Kiểm soát dịch bệnh Hoa Kỳ (CDC) nhằm tạo cơ sở hỗ trợ kỹ thuật phát hiện virus H5N1, phân lập virus, tập huấn kỹ thuật. Nhờ đó đến cuối tháng 8/2003 Viện Thú y đã có đủ khả năng về con người và vật liệu để xác định chủng H5 virus cúm gia cầm. Với sự giúp đỡ của CDC, chủng virus cúm gia cầm lưu hành ở Việt Nam được xác định là chủng H5N1 và công bố dịch vào ngày 8/1/2004.
Chủng H5N1 không chỉ có mặt ở đàn gà mà còn gây bệnh cho cả ngan. Việc xác định H5N1 ở ngan đã chỉ rõ rằng thủy cầm cũng nhiễm bệnh và trở thành một trong những con đường truyền lây quan trọng. Ngoài ra một số mẫu virus phân lập từ vịt thuộc loại H3N8.
Trước nguy cơ bệnh cúm gia cầm có thể truyền cho lợn, tái tổ hợp ở vật chủ này rồi lây sang người. Viện đã lấy 188 mẫu dịch mũi lợn ở 3 tỉnh Hà Tây, Thái Bình, Hải Phòng tại vùng dịch đang xảy ra, đã xảy ra và xung quanh vùng dịch. Kết quả phân lập không phát hiện thấy virus cúm H5N1 [8].
Qua phân tích trình tự nucleotide 8 đoạn ARN của 9 chủng virus cúm H5N1 từ người (2 chủng), chim cút (1 chủng), vịt (2 chủng), và gà (4 chủng) trong đợt dịch 2003 - 2004 và lập cây phả hệ, Bùi Tiến Dũng và cộng sự cho thấy các chủng virus H5N1 lưu hành ở Việt Nam đều giống nhau, có cùng nguồn gốc từ Trung Quốc và xuất phát từ một ổ dịch ban đầu [10].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Nghiên cứu khác của Nguyễn Tiến Dũng và cộng sự trên đàn gia cầm của tỉnh Thái Bình và Đồng bằng sông Cửu Long cho thấy ngoài virus cúm H5N1, đàn gia cầm còn nhiễm các loại virus typ A có kháng nguyên H3, H4, H6, H9, H11và H12 với tỷ lệ nhiễm khác nhau [11, 12].
Một nghiên cứu khác của Viện Thú y về sự lưu hành của virus trong đàn chim di cư qua việc phân tích 320 mẫu phân chim tại một số địa phương trong đó có Vườn Quốc gia Xuân Thủy - Giao Thủy - Nam Định bằng phương pháp RT - PCR, kết quả không phát hiện thấy virus cúm.
Khi dịch cúm gia cầm xảy ra, Lê Văn Năm đã có nghiên cứu về đặc điểm dịch tễ, các biểu hiện lâm sàng, các đặc điểm bệnh lý ở gà, ngan, vịt, chim cút, gà tây, chim vẹt cảnh và đã có những kết luận rất cần thiết cho công tác chẩn đoán lâm sàng tại cơ sở [24].
Viện Thú y đã nghiên cứu thử nghiệm vacxin H5N2 của Intervet (Hà Lan); H5N2 và H5N1 của Trung Quốc. Kết quả cho thấy vaccine tiêm cho đàn gia cầm đều đạt yêu cầu về độ tinh khiết, độ an toàn và hiệu lực theo đúng tiêu chuẩn của nhà sản xuất. Đặc biệt vaccine H5N1 của Trung Quốc có thể tiêm cho đàn vịt có huyết thanh dương tính vẫn đạt tỉ lệ bảo hộ tốt và an toàn.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Chƣơng 2
NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
2.1.1. Điều tra tình hình dịch bệnh và thống kê thiệt hại kinh tế do dịch cúm gia cầm gây ra từ năm 2003 đến năm 2009 tại Bắc Ninh. cúm gia cầm gây ra từ năm 2003 đến năm 2009 tại Bắc Ninh.
2.1.2. Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ của bệnh cúm gia cầm. 2.1.3. Kết quả tiêm phòng cúm gia cầm của tỉnh Bắc Ninh năm 2009 2.1.3. Kết quả tiêm phòng cúm gia cầm của tỉnh Bắc Ninh năm 2009 2.1.4. Giám sát lâm sàng trên đàn gia cầm sau tiêm phòng.
2.1.5. Giám sát huyết thanh học trên đàn gia cầm sau tiêm vacxin. 2.2. VẬT LIỆU 2.2. VẬT LIỆU
2.2.1. Đối tƣợng kiểm tra
Gà đẻ trứng, gà ông bà và vịt đã được tiêm phòng vacxin cúm H5N1 trên địa bàn tỉnh Bắc Ninh.
2.2.2. Vacxin
Vacxin vô hoạt subtype H5N1, chủng Re - 1 (A/Harbin/Re - 1/2003).
2.2.3. Các hoá chất dùng trong xét nghiệm
* Môi trường và hoá chất bảo quản bệnh phẩm
- Môi trường Glycerol Pha chế PBS: NaCl 8g KCl 0,2 g Na2HPO4 1,15 g KH2PO4 0,2 g Nước cất vđ 1000 ml
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hấp vô trùng 121o (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
C/ 15 phút, bổ xung kháng sinh có trộn với glycerol theo tỷ lệ 1:1.
* Chuẩn bị các dung dịch và xử lý huyết thanh
- Dung dịch PBS 0,01M, pH 7,2
Na2HPO4 1,096 g
NaH2PO4.H2O 0,316 g
Na Cl 8,5 g
Nước cất 1000 ml
Chỉnh pH = 7,2 bằng NaOH 1N hoặc HCl 1N, hấp vô trùng, bảo quản 4oC không quá 3 tuần.
- Dung dịch nước muối sinh lý 0,85%:
Pha 8,5 g NaCl trong 1000 ml nước cất. Hấp vô trùng, bảo quản 4oC không quá 3 tuần.
- Dung dịch hồng cầu gà 1%:
+ Máu gà trống khoẻ mạnh đã trưởng thành, không có kháng thể kháng virus cúm và Newcastle.
+ Dùng bơm tiêm 5 - 10ml hút sẵn 1ml (10% thể tích) dung dịch chống đông (Natri Citrat 4%) rồi lấy máu gà vào ống nghiệm.
+ Ly tâm 1000 - 1500 vòng/phút, trong 15 phút, gạn bỏ huyết tương,
cho thêm nước sinh lý (NaCl 0,85%) vào hồng cầu, lắc đều. Ly tâm như trên
3 - 4 lần để rửa hồng cầu, sau lần ly tâm cuối gạn bỏ nước ở trên.
+ Pha hồng cầu với nước muối sinh lý thành huyễn dịch 1%: pha 1 ml hồng cầu với 99 ml nước muối sinh lý.
+ Bảo quản huyễn dịch hồng cầu ở nhiệt độ 4 - 8oC. Hồng cầu sau khi
pha có thể dùng trong 4 - 5 ngày (nếu dung dịch hồng cầu bị dung huyết thì
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
* Kháng huyết thanh chuẩn:
- Kháng huyết thanh chuẩn của các loài như thỏ, dê, cừu... cần được xử lý bằng RDE (Receptor Destroying Enzyme) trước khi xét nghiệm.
- Kháng huyết thanh chế trên gà không cần xử lý bằng RDE. Tuy nhiên, nếu phản ứng cho kết quả không rõ ràng thì kháng huyết thanh có thể xử lý RDE để khẳng định kết quả là dương tính.
- Hoàn nguyên kháng huyết thanh và bảo quản ở nhiệt độ - 20oC, xử lý
của yếu tố ức chế đặc hiệu kháng huyết thanh vô hoạt.
- Trộn 3 phần RDE với 1 phần kháng huyết thanh, ủ ở nhiệt độ 37oC trong nồi đun cách thuỷ qua đêm.
- Ủ tiếp ở nồi đun cách thuỷ nhiệt độ 56oC/30 phút để vô hoạt RDE
còn dư.
- Kháng huyết thanh đã xử lý để nguội, cho thêm 6 phần nước sinh lý (0,3ml HT + 1,8ml SL), độ pha loãng cuối cùng của kháng huyết thanh là 1/10.
2.2.4. Các trang thiết bị và cơ sở vật chất (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Các trang thiết bị và cơ sở vật chất của phòng virus - Trung tâm Chẩn đoán Thú y TW, Chi Cục Thú y tỉnh Bắc Ninh.
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1. Phƣơng pháp nghiên cứu dịch tễ
Sử dụng phương pháp nghiên cứu khứ hồi, căn cứ vào báo cáo của Chi cục Thú y tỉnh và viện giám sát thống kê để phân tích.
Sử dụng phương pháp cắt ngang trong nghiên cứu thực tế.
Sử dụng các phương pháp nghiên cứu dịch tễ học mô tả (Descriptive epidemiology study), dịch tễ học phân tích (Analytic epidemiology study) và dịch tễ học thực nghiệm.
2.3.2. Thống kê một số chỉ tiêu liên quan đến chăn nuôi và dịch cúm gia cầm của tỉnh Bắc Ninh cầm của tỉnh Bắc Ninh
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
2.3.3. Giám sát một số chỉ tiêu của đàn gia cầm sau tiêm phòng vacxin H5N1 của tỉnh Bắc Ninh H5N1 của tỉnh Bắc Ninh
Dựa theo hướng dẫn qui chế giám sát sau tiêm phòng, chúng tôi tiến hành giám sát đàn gia cầm sau khi tiêm vacxin ngoài thực địa.
2.3.3.1. Giám sát lâm sàng
Sau khi tiêm phòng vaccine cúm gia cầm cho đàn gia cầm toàn tỉnh, chúng tôi tiến hành theo dõi đàn gia cầm bằng các phương pháp:
+ Phỏng vấn trực tiếp.
+ Dùng phiếu điều tra các hộ, trang trại chăn nuôi.
+ Theo dõi trực tiếp tại 3 huyện thành phố với 2 đàn gà và 1 đàn vịt khác nhau sau mỗi đợt tiêm phòng.
2.3.3.2. Giám sát huyết thanh
- Đánh giá đáp ứng miễn dịch của các đàn gà trong tỉnh và gà thí nghiệm được tiêm vacxin H5N1 tại các thời điểm 1, 3 và 5 tháng sau tiêm vaccine.
- Trực tiếp tiêm và theo dõi sau tiêm phòng trên 1 đàn gà thí nghiệm là đàn gà đẻ trứng thương phẩm của một hộ gia đình trong tỉnh.
- Đánh giá đáp ứng miễn dịch của các đàn vịt trong tỉnh và vịt thí nghiệm được tiêm vacxin H5N1 tại các thời điểm sau khi tiêm: 1 và 3 tháng
Đàn vịt thí nghiệm là đàn vịt của một hộ gia đình trong tỉnh do chúng tôi trực tiếp tiêm đàn vịt này và được nuôi dưỡng, chăm sóc giống như các đàn vịt khác trong tỉnh.
2.3.3.3. Lấy mẫu
- Đàn được lấy mẫu được chọn ngẫu nhiên từ các đàn gia cầm được tiêm vaccine trong tỉnh.
- Phương pháp lấy mẫu huyết thanh:
Đối tượng lấy mẫu là huyết thanh gà, vịt được tiêm vacxin H5N1 đang được nuôi tại tỉnh Bắc Ninh.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Nhổ hết lông tại vị trí lấy máu (mặt dưới cánh). Sát trùng bằng bông cồn cho nổi rõ tĩnh mạch cánh. Dùng bơm tiêm loại 5ml, chọc kim vào tĩnh mạch theo chiều hướng đầu kim vào phía trong cơ thể gia cầm, lấy từ 2 -3ml máu/con, sau đó kéo dài pittong ra đến 5ml, bẻ gập đầu kim, đậy nắp kim lại, để nghiêng cho máu đông tự nhiên, chắt lấy huyết thanh.
Mẫu huyết thanh có thể để ở nhiệt độ 40C (bảo quản trong hộp xốp đựng đá) trong vòng 48 giờ, nếu bảo quản lâu hơn, giữ ở nhiệt độ - 200
C, được đưa đến phòng xét nghiệm của Trung tâm chẩn đoán thú y trung ương trong điều kiện lạnh (phích đá) càng sớm càng tốt, có phiếu gửi bệnh phẩm kèm theo.
* Gà, vịt chỉ báo: Gà, vịt trên địa bàn tỉnh Bắc Ninh không được tiêm vacxin cúm H5N1, dùng để làm đối chứng. Chúng tôi lấy mẫu huyết thanh