2.1. Ảnh hƣởng của co-culture với tế bào sợi bào thai chuột lên sự thành thục trứng. thục trứng.
Để đánh giá ảnh hƣởng của việc bổ sung tế bào sợi thai chuột vào môi trƣờng nuôi trứng lên chất lƣợng trứng, chúng tơi tiến hành thí nghiệm khảo sát và so sánh tỉ lệ thành thục ở lô trứng đƣợc nuôi với tế bào sợi thai chuột với lô đối chứng nuôi ở môi trƣờng nuôi thông thƣờng. Trứng đƣợc thu riêng rẽ ở các nang có kích thƣớc >3mm và 2-3mm
Với lơ thí nghiệm.
Tế bào sợi thai chuột sau khi nuôi trong đĩa 4 well ở các pasat 2-3 sẽ đƣợc tiến hành mitomycin, nuôi tiếp trong Dmem 10% trong 1 ngày sao cho đạt mật độ 300.000 – 400.000 tế bào/ 1 well. Tiến hành thay môi trƣờng Dmem bằng môi trƣờng IVM I và để trong tủ ấm trƣớc khi ni trứng ít nhất 3 h. Trứng lợn sau khi thu sẽ đƣợc phân loại rồi nuôi trong các well có chứa tế bào sợi thai chuột đã chuẩn bị sẵn ở trên, mỗi well nuôi từ 40 - 60 trứng. Nuôi trong 22-24 h, hút sạch môi trƣờng cũ, rửa lại trứng bằng môi trƣờng IVM II, rồi tiếp tục nuôi trứng trong môi trƣờng IVM II trong 22-24h ở các well cũ có chứa tế bào sợi thai chuột. Sau 44 h trứng đƣợc tách cumulus để kiểm tra tỉ lệ thành thục.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 45
Trứng sau khi thu sẽ nuôi riêng rẽ trong môi trƣờng nuôi trứng Mat I trong thời gian 22 giờ và Mat II trong 22 giờ. Sau 44 giờ tiến hành tách tế bào cumulus và kiểm tra tỉ lệ thành thục.
Tỉ lệ trứng thành thục đƣợc tính bằng tỉ lệ trứng có thể cực thứ nhất trên tổng số trứng đem ni. Kết quả chúng tơi thu đƣợc trình bày ở bảng 3.
Bảng 3: Ảnh hƣởng của tế bào sợi thai chuột lên tỉ lệ thành thục của trứng lợn
Các kí hiệu a,b theo hàng chỉ độ sai khác với mức ý nghĩa p< 0,05
Từ kết quả thu đƣợc ở trên, chúng tôi nhận thấy việc bổ sung tế bào sợi thai chuột có ảnh hƣởng tích cực tới việc nâng cao tỉ lệ chín của trứng lợn sau ni IVM. Đối với trứng thu đƣợc từ những nang có kích thƣớc > 3 mm khi bổ sung tế bào sợi thai chuột vào q trình ni làm tăng tỉ lệ trứng chín từ 51,76% ± 4,82 lên tới 77,93%. ± 8,94. Đối với trứng thu đƣợc từ nang có kích thƣớc 2-3 mm cũng cho kết quả tƣơng tự khi tỉ lệ trứng thành thục ở lơ thí nghiệm là 55,21±5,58 % , cao hơn so với lô đối chứng là 33,03±2,13 %. Ngoài ra, khi quan sát hình thái trứng bằng mắt thƣờng qua kính hiển vi, ở lơ Kích
thƣớc nang
Lơ đối chứng Lơ thí nghiệm
Số trứng tách Số trứng thành thục Tỉ lệ thành thục TB±SD Số trứng tách Số trứng thành thục Tỉ lệ thành thục TB±SD >3mm 52 27 51.76±4,82a 50 39 77.93±8,94b 2-3 mm 51 17 33.03±2,13a 56 31 55.21±5,58b
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 46
thí nghiệm ni trứng với tế bào sợi thai chuột cho thấy trứng sau IVM II tơi, đẹp, tế bào chất đồng đều và màng trứng sáng hơn so với lô đối chứng.
2. 2. Ảnh hƣởng của co-culture với tế bào màng trong vòi trứng (oviduct cell) lên sự thành thục của trứng. cell) lên sự thành thục của trứng.
Tế bào màng trong vòi trứng sau khi thu sẽ đƣợc nuôi trong 199 NaHCO3 đến ngày thứ 2, kiểm tra và nhặt những cụm đạt tiêu chuẩn. Rửa bằng mơi trƣờng IVM I ít nhất 2 lần, cho vào môi trƣờng IVM I trong đĩa 4 well đã chuẩn bị sẵn và đƣợc làm ấm. Mỗi well cho khoảng 20 cụm tế bào.
Trứng lợn sau khi thu và phân loại dựa vào kích thƣớc nang sẽ đƣợc ni trong các well có chứa IVM I và tế bào màng trong vòi trứng. Sau 22- 24 h chuyển sang IVM II cũng có chứa tế bào mới, đã đƣợc chuẩn bị trƣớc. Tiếp tục nuôi trong 24h, tiến hành tách để kiểm tra tỉ lệ thành thục. Kết quả thí nghiệm đƣợc thể hiện ở bảng 4.
Bảng 4: Ảnh hƣởng của tế bào màng trong vòi trứng lên chất lƣợng trứng lợn sau ni.
Các kí hiệu a,b theo hàng chỉ độ sai khác với mức ý nghĩa p< 0,05 Kích
thƣớc nang
Lơ đối chứng Lơ thí nghiệm
Số trứng tách Số trứng thành thục Tỉ lệ thành thục TB±SD Số trứng tách Số trứng thành thục Tỉ lệ thành thục TB±SD >3mm 51 28 54,93±1,17a 32 25 76,39±2,05b 2-3 mm 32 10 30,44±9,34a 29 16 55,17±6,72b
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 47
Đối với trứng thu từ nang có kích thƣớc > 3mm và đƣợc ni trong mơi trƣờng có chứa tế bào màng trong vịi trứng chúng tôi tiến hành tách 3 lơ với tổng số 32 trứng thì có 25 trứng thành thục, đạt tỉ lệ chín là 76,39±2,05 %. Lơ đối chứng khi ni trong mơi trƣờng IVM thì có 28/51 trứng thành thục, đạt 54,93±1,17 %.
Tƣơng tự với trứng đƣợc thu từ nang có kích thƣớc 2-3 mm, với 3 lần thí nghiệm, tổng số trứng tách là 29 quả thì có 16 trứng thành thục, đạt tỉ lệ thành thục là 55,17±6,72 %, cao hơn so với lô đối chứng (thành thục 10/32 quả, đạt 30,44±9,34 %)
Từ kết quả thu đƣợc giữa lơ thí nghiệm và lơ đối chứng chúng tôi nhận thấy khi bổ sung tế bào màng trong vịi trứng vào mơi trƣờng ni trứng đã làm tăng tỉ lệ trứng thành thục ở các lơ thí nghiệm. Mặt khác, khi bổ sung tế bào màng trong vòi trứng vào môi trƣờng nuôi trứng, ta thấy trứng bông tơi và lớp tế bào cumulus phát triển dày đặc xung quanh trứng.
2.3. Ảnh hƣởng của co-culture cùng lúc với với tế bào sợi bào thai chuột và tế bào màng trong vòi trứng lên sự thành thục của trứng. và tế bào màng trong vòi trứng lên sự thành thục của trứng.
Từ những kết quả thu đƣợc ở trên ta nhận thấy khi bổ sung vào môi trƣờng nuôi trứng lợn tế bào sợi thai chuột hoặc tế bào màng trong vịi trứng đã nâng cao chất lƣợng trứng và phơi lợn thụ tinh ống nghiệm. Vì vậy chúng tơi tiến hành thử nghiệm mức độ ảnh hƣởng tới chất lƣợng trứng và phôi lợn khi bổ sung vào môi trƣờng nuôi trứng cả hai loại tế bào này. Trong đó khoảng 40- 50 trứng đƣợc nuôi trong 1 well môi trƣờng IVM I có bổ sung 300.000 – 400.00 tế bào sợi thai chuột và khoảng 20-23 cụm tế bào màng trong vịi trứng. Trứng đƣợc ni và chuyển sang môi trƣờng IVM II có bổ
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 48
sung tế bào tƣơng tự nhƣ môi trƣờng IVM I ở trên. Sau 42-44 giờ nuôi, tiến hành tách để kiểm tra tỉ lệ trứng thành thục.
Bảng 5: Ảnh hƣởng của việc bổ sung cả hai loại tế bào vào môi trƣờng nuôi trứng lên tỉ lệ thành thục của trứng lợn.
Các chỉ số a,b theo hàng chỉ độ sai khác với mức ý nghĩa p< 0,05
Việc bổ sung cả 2 loại tế bào trên vào môi trƣờng nuôi trứng đã làm tăng đáng kể tỉ lệ thành thục của trứng sau khi nuôi ở cả 2 loại kích thƣớc nang. Với trứng thu đƣợc từ nang > 3mm, khi bổ sung vào môi trƣờng nuôi cả 2 loại tế bào đã làm tăng tỉ lệ thành thục của trứng từ 52.51±4,32%lên 78.26±1,38%. Kết quả tỉ lệ thuận đối với trứng thu đƣợc ở các nang 2-3mm .