1.1. Đối tƣợng thí nghiệm.
Nguồn mẫu đƣợc sử dụng trong thí nghiệm này là buồng trứng lợn nhà, giống lợn Yorkshire đƣợc thu từ lò mổ trên địa bàn thành phố Hà Nội. Lò mổ Minh Hiền, Thanh Oai, Hà Nội.
Thời gian tiến hành thu mẫu: Từ tháng 3 năm 2012 đến tháng 8 năm 2012
1.2. Dụng cụ thí nghiệm.
- Đĩa petri nhựa đƣờng kính 35 mm - Đĩa petri nhựa đƣờng kính 90 mm - Đĩa 4 well
- Bơm tiêm 10 ml, kim tiêm 18G
- Màng lọc minisart (đƣờng kính lỗ lọc 0,2 µm)
- Micropipet+ đầu cơn tƣơng ứng loại 0,5 µl, 10- 100 µl, 100-µl - Kim thu trứng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 32 - Bàn giữ ấm
- Một số dụng cụ khác nhƣ: Bình tam giác, bình định mức, kéo, cốc thủy tinh, máy ảnh … 1.3. Thiết bị thí nghiệm. - Kính hiển vi đảo ngƣợc - Tủ hút vô trùng - Tủ ni trứng và phơi - Cân phân tích - Tủ lạnh - Máy li tâm
- Ngân hàng trữ tinh đơng lạnh.
1.4. Hóa chất và mơi trƣờng
- Môi trƣờng thu nhận buồng trứng: Dung dịch nƣớc muối sinh lí 0,9% có bổ xung gentamycine (Việt Nam, 150 µg/ml) đƣợc khử trùng trƣớc khi sử dụng. Môi trƣờng này đƣợc làm ấm ở 370
C tiến hành thu buồng trứng và rửa buồng trứng 4 lần tại lò mổ. Sau đó buồng trứng đƣợc bảo quản ở 370C trong suốt q trình vận chuyển về phịng thí nghiệm.
- Môi trƣờng rửa trứng: m-DPBS (Modified Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline) đƣợc sử dụng để thu nhận và rửa tế bào trứng trƣớc khi đem nuôi. Thành phần: Môi trƣờng PBS(-) NaCl 4g KCl 0,1g Na2HPO4 0,575g KH2PO4 0,1g Nƣớc cất 350ml
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 33 Môi trƣờng PBS(+)
CaCl2 0,05g MgCl2.6H2O 0,05g Nƣớc cất 100ml
Sau khi chuẩn bị xong, rót từ từ PBS(+) vào PBS(-)vđể tránh kết tủa. Bổ sung 0,5g glucose và 0,018g natri pyruvate kèm theo 625 µl gentamycine (nồng độ 50 µl /ml). Bổ sung nƣớc cất vô trùng cho đủ 500 ml. Sau đó lọc qua màng lọc trong điều kiện vô trùng và bảo quản ở 40C.
- Môi trƣờng nuôi thành thục trứng In vitro.
+) Môi trƣờng IVM1 (Abeydeera và cs, 1998) sử dụng nuôi tế bào trứng từ ngay sau khi thu và trong khoảng từ 22 đến 24 giờ. Thành phần chủ yếu là môi trƣờng TCM- 199 có bổ xung dịch nang trứng, hCG, L-cystein, PMSG, Natri pyruvate. Thành phần: TCM-199 pFF 10% Natri pyruvate 20mg/ml eGF 10ng/ml L-cystein 10ng/ml hCG 10 IU/ml PMSG 10 IU/ml Kanamycine 8mg/100ml.
+) Môi trƣờng IVM2 (Abeydeera và cs, 1998) sử dụng để nuôi thành thục trứng trong khoảng thời gian từ 24 đến 44 giờ sau khi thu. Thành phần chủ yếu là mơi trƣờng TCM-199 có bổ sung pFF, eCG, Natri Pyruvate. Về cơ
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 34
bản. thành phần của môi trƣờng IVM2 giống với môi trƣờng IVM1 nhƣng không bổ sung hormone hCG và PMSG.
- Môi trƣơng tách cumulus: enzyme hyaluronidase (Sigma, Mỹ) nồng độ 0,1% Tất cả các môi trƣờng trên trƣớc khi sử dụng đều đƣợc mọc qua màng lọc minisart có đƣờng kính lỗ là 0,2 µmvà vơ trùng.
Môi trƣờng thụ tinh ống nghiệm
Tế bào trứng thành thụcbvà tinh trùng hoạt hóa đƣợc chuyển sang mơi trƣờng thụ tinh để thực hiện quá trình xâm nhập hình thành tiền nhân, kết hợp hai tiền nhân tạo thành hợp tử. Để thực hiện q trình này cần phải có số lƣợng tinh trùng, thời gian tiếp xúc và mơi trƣờng thích hợp để đạt đƣợc hiệu quả thụ tinh thành hợp tử. Sau thụ tinh, hợp tử phát triển thành phôi với tỷ lệ cao.
Trong các môi trƣờng thụ tinh invitro các chất cần thiết cho sự hoạt động của tinh trùng thuộc ba nhóm: muối, cơ chất năng lƣợng (glucose, pyruvate, lactate) và nguồn protein ion Ca2+
, bicarbonat, tỉ lệ Na+/K+
pH của môi trƣờng IVF vào khoảng 7,4= pH máu, thích hợp cho sự thụ tinh và q trình phát triển ban đầu của phơi.
Khi thụ tinh hoặc nuôi phôi, cần thiết phải phủ lên bề mặt của môi trƣờng ni một lớp dầu khống để làm giảm q trình tạo hạt ngƣng tụ trong môi trƣờng cũng nhƣ làm thay đổi nồng độ các chất.
Nồng độ tinh trùng hoạt hóa để thụ tinh ở động vật có vú vào khoảng 105- 106 tinh trùng/ml. Ở heo vào khoảng 4-5.108-109/ml. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});