5. Thời gian
2.4.2. Phƣơng phỏp phỏt hiện khỏng nguyờn
2.4.2.1. Phõn lập vi rỳt trờn trứng cú phụi
- Chọn trứng cú phụi 9-10 ngày tuổi khoẻ mạnh, 3 trứng/bệnh phẩm. - Lau trứng bằng cồn 70% và đục lỗ nhỏ phớa trờn buồng hơi.
- Dựng syringe 1 ml lắp kim và hỳt dịch bệnh phẩm (đó xử lý ở trờn) tiờm vào xoang niệu mụ với lƣợng 0,2 ml/trứng.
- Ấp trứng tiếp 2-3 ngày ở nhiệt độ 370C.
- Theo dừi sau khi tiờm, soi trứng ngày 2 lần. Những trứng chết đƣợc cất vào tủ lạnh 40C để kiểm tra. Trứng chết hoặc sống đƣợc cất vào tủ lạnh 40C qua đờm hoặc ớt nhất 4 giờ trƣớc khi thu hoạch.
- Lau trứng bằng cồn 70%.
- Dựng panh và kộo vụ trựng cắt vỏ trứng, bộc lộ buồng hơi, gạt màng xoang niệu mụ sang bờn.
- Thu dịch niệu mụ vào ống nghiệm.
2.4.2.2. Kiểm tra nước trứng bằng phản ứng HA
- Nhỏ 25àl PBS 0,01M vào đĩa 96 giếng chữ V từ giếng thứ 1 đến giếng 12 của mỗi hàng.
- Cho 25 àl dịch niệu mụ vào giếng thứ 1.
- Pha loóng khỏng nguyờn bằng cỏch chuyển 25 àl dịch niệu mụ từ giếng thứ 1 sang giếng thứ 2 và tuần tự đến giếng 11 thỡ bỏ đi 50 àl .
- Nhỏ thờm 25 àl PBS vào cỏc giếng.
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn
56
- Lắc đĩa bằng mỏy hoặc bằng tay.
- Ủ đĩa phản ứng ở nhiệt độ phũng, thời gian khoảng 40 phỳt.
Đọc kết quả: Hiệu giỏ HA của vi rỳt đƣợc tớnh ở độ pha loóng khỏng nguyờn cao nhất cũn hiện tƣợng ngƣng kết hồng cầu.
- Nếu HA dƣơng tớnh, chứng tỏ cú vi rỳt. Tiếp tục giỏm định bằng phản ứng HI với khỏng huyết thanh chuẩn của một số subtyp H vi rỳt cỳm A và khỏng huyết thanh chuẩn Newcastle để xỏc định loại vi rỳt phõn lập.
- Nếu HA õm tớnh mà phụi chết, cú bệnh tớch phụi, lấy nƣớc trứng tiờm truyền lần 2.
- Nếu HA õm tớnh, phụi phỏt triển bỡnh thƣờng, cú thể tiờm lại hoặc khụng. - Bảo quản virus phõn lập đƣợc ở -700C.
2.4.2.3. Giỏm định vi rỳt phõn lập bằng phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu - HI - Pha khỏng nguyờn 4HA/25 àl: Lấy độ pha loóng cuối cựng cú phản ứng ngƣng kết hồng cầu chia cho 4.
Vớ dụ: Hiệu giỏ HA của dịch niệu mụ là 1/128. Đơn vị 4 HA = 128: 4 = 32.
Nhƣ vậy sẽ trộn 1 phần dịch nƣớc trứng với 31 phần PBS để đạt đƣợc dung dịch khỏng nguyờn 4HA.
- Chuẩn độ khỏng nguyờn 4 HA:
Sau khi pha, khỏng nguyờn 4HA phải đƣợc chuẩn độ lại. Tiến hành: Nhƣ phản ứng HA.
+ Pha chuẩn: Kết quả ngƣng kết xảy ra ở 2 giếng đầu. + Pha khụng chuẩn:
Khỏng nguyờn đặc: Nếu ngƣng kết đến giếng thứ 3 tức là thừa khỏng nguyờn. Nhƣ vậy, khỏng nguyờn 8HA phải đƣợc pha loóng (cú thể gấp đụi) để cú ngƣng kết đến giếng thứ 2.
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn
56
thiếu khỏng nguyờn, cú thể thờm một lƣợng khỏng nguyờn (bằng với lƣợng
khỏng nguyờn pha ban đầu) để cú ngƣng kết đến giếng thứ 2.
- Tiến hành phản ứng HI: Trờn 1 đĩa cú thể tiến hành phản ứng HI với nhiều khỏng huyết thanh của cỏc subtyp khỏc nhau.
+ Nhỏ 25 àl PBS vào cỏc giếng của đĩa 96 giếng. + Nhỏ tiếp 25 àl khỏng huyết thanh vào giếng đầu tiờn.
+ Pha loóng khỏng huyết thanh theo cơ số 2, bằng cỏch chuyển 25 àl khỏng huyết thanh từ giếng 1 sang giếng 2 và tuần tự đến giếng 11 và bỏ đi 25 àl cuối cựng.
+ Nhỏ 25 àl khỏng nguyờn 4HA đó chuẩn bị vào cỏc giếng từ giếng 1 đến giếng 11. Thờm 25 àl PBS vào hàng đối chứng hồng cầu (giếng 12).
+ Lắc đĩa và ủ ở nhiệt độ phũng 30 phỳt.
+ Nhỏ 25 àl dung dịch hồng cầu vào tất cả cỏc giếng của đĩa, lắc đều.
Đọc kết quả:
- Phản ứng (+) dƣơng tớnh: Hồng cầu lắng xuống đỏy. Nhƣ vậy, vi rỳt phõn lập và khỏng huyết thanh chuẩn tƣơng ứng với nhau.
- Xỏc định subtyp: Một vi rỳt phõn lập đƣợc xỏc định subtyp khi nú phản ứng với một khỏng huyết thanh chuẩn hiệu giỏ cao hơn 4 lần so với cỏc khỏng huyết thanh chuẩn khỏc. Hiệu giỏ càng cao chứng tỏ sự tƣơng đồng của vi rỳt phõn lập với khỏng huyết thanh chuẩn càng lớn.
2.4.2.4. Phương phỏp RT-PCR
a. Chiết tỏch ARN từ mẫu dịch ngoỏy (Phương phỏp QiagenRNeasy)
- Lắc mạnh (bằng mỏy Vortex) ống chứa dịch ngoỏy và chuyển lƣợng 500 àl sang ống ly tõm nhỏ và ghi ký hiệu mẫu. Cho 500 àl Qiagen buffer RLT cú β-ME vào ống ly tõm trờn. Lắc đều bằng mỏy Vortex.
- Ly tõm (bằng mỏy Spindown) để dịch bệnh phẩm đọng trờn nắp trụi xuống đỏy ống. Cho 500 àl cồn ETOH 70% (ethanol), lắc mạnh bằng Vortex. Ly tõm mẫu đó bị dung giải trong 5 phỳt ở tốc độ 5000vg ở nhiệt độ phũng.
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn
56
- Chuyển tất cả dịch nổi chứa mẫu bị dung giải sang cột RNeasy
Qiagen đó ghi sẵn ký hiệu mẫu. Ly tõm trong 15 giõy tốc độ ≥8000vg ở nhiệt độ phũng. Kiểm tra dịch mẫu đó thấm qua cột lọc chƣa. Lặp lại bƣớc này cho đến khi toàn bộ mẫu đó qua cột lọc.
- Bổ sung 700 àl dung dịch rửa 1 (RW1 buffer) vào cột Rneasy Qiagen, ly tõm trong 15 giõy ở tốc độ ≥8000vg, thay ống thu mẫu mới (collection tube) vào cột lọc. Cho 500 àl RPE buffer vào cột RNeasy và ly tõm trong 15 giõy ở tốc độ ≥8000vg, thay ống thu mẫu mới vào cột lọc.
- Lặp lại bƣớc trờn 2 lần với dung dịch rửa RPE buffer. Sau lần rửa cuối cựng thay ống thu mẫu mới loại 2 ml vào cột lọc. Ly tõm cột lọc trống khụng trong 2 phỳt ở tốc độ tối đa (khoảng 12.000 vũng/phỳt), bỏ ống thu mẫu.
- Đặt cột lọc vào ống thu hoạch hoặc ống 1,5 ml đó đƣợc ghi sẵn ký hiệu mẫu. Cho 50 àl RNase free H2O vào cột lọc. Chỳ ý khụng đƣợc chạm đầu tip vào mặt thạch Silica trong cột lọc. Ủ ở nhiệt độ phũng trong ớt nhất 1 phỳt. Tỏch ARN bằng cỏch ly tõm cột trong 1 phỳt ở 10.000 vũng/phỳt. Bỏ cột lọc RNeasy.
- Bảo quản mẫu ARN thu đƣợc ở 40C trong thời gian ngắn trƣớc khi làm RT-PCR. Nếu làm sau 24 giờ, mẫu nờn bảo quản ở -200C hoặc nhiệt độ thấp hơn.
b. Tiến hành phản ứng RT-PCR * Dụng cụ:
- Ống 25 àl Smart Cycler (catalog 900-0022 hoặc 900-0003, Cepheid Smart Cycler, Sunnyvale, CA).
- Giỏ ống phản ứng PCR làm lạnh đƣợc và mỏy li tõm ống nhỏ . Cả 2 thiết bị này đƣợc cung cấp kốm theo hệ thống mỏy Smart Cycler hệ thống bơm hỳt chõn khụng 24 van QiaVac cú khả năng hỳt 18-20 lớt/phỳt.
* Nguyờn liệu:
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn
56
- ARN đối chứng dƣơng tớnh M, H5 và H7 (đƣợc NVSL cung cấp). - Cồn tuyệt đối.
- Isopropanol, 99+% tinh khiết. - Chloroform, 99+% tinh khiết. - Trizolđ LS reagent.
