5. Thời gian
2.2. NỘI DUNG NGHIấN CỨU
2.2.1. Một số đặc điểm dịch tễ của bệnh cỳm gia cầm
- Biến động tỷ lệ xuất hiện bệnh cỳm gia cầm theo loài, theo phƣơng thức chăn nuụi, theo mựa vụ, và theo quy mụ đàn nuụi trong những năm qua (từ năm 2008 đến năm 2011).
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn
56
2.2.2. Sự đỏp ứng miễn dịch và độ dài miễn dịch của đàn gà, đàn vịt đƣợc tiờm vaccine H5N1 năm 2011
- Giỏm sỏt huyết thanh học và vi rỳt học của đàn gà, vịt trƣớc khi tiờm vaccine.
- Đỏnh giỏ đỏp ứng miễn dịch của đàn gà, vịt trờn toàn tỉnh đƣợc tiờm vaccine tại cỏc thời điểm sau khi tiờm: 30 ngày, 60 ngày, 90 ngày, 120 ngày, 150 ngày.
- So sỏnh mức độ phõn bố hiệu giỏ khỏng thể của đàn gà, vịt đƣợc tiờm vaccine sau cỏc thời điểm: 30 ngày. 60 ngày, 90 ngày, 120 ngày, 150 ngày. Qua đú xỏc định đƣợc độ dài miễn dịch.
Nhúm gà đƣợc tiờm vaccine lấy trung bỡnh 40 mẫu/huyện, nhúm gà chỉ bỏo lấy 40 mẫu/huyện.
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn
56
Sơ đồ giỏm sỏt huyết thanh và vi rỳt
( + ) ( - ) ( - ) ( + ) Kết luận Phõn lập vi rỳt Giỏm định Phõn lập 2 Mẫu bệnh phẩm
(huyết thanh, swab, phủ tạng…)
Phỏt hiện khỏng thể
Phỏt hiện vi rỳt
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn
56
2.3. NGUYấN LIỆU NGHIấN CỨU
* Gà, vịt giống, gà, vịt trứng thƣơng phẩm đó đƣợc tiờm phũng vaccine cỳm gia cầm H5N1.
* Vaccine cỳm gia cầm H5N1 và do Cụng ty Phỏt triển Cụng nghệ Sinh học Harbin Weike (Trung Quốc) sản xuất.
* Cỏc hoỏ chất dựng trong xột nghiệm:
Mụi trƣờng và hoỏ chất bảo quản bệnh phẩm.
- Mụi trƣờng 199 chứa 0,5% BSA (Albumin huyết thanh bũ) cú bổ sung khỏng sinh. - Mụi trƣờng Glycerol.
- Dung dịch PBS.
- Dung dịch nƣớc muối sinh lý 0,85 %.
- Dung dịch hồng cầu gà 1%: Mỏu gà trống khoẻ mạnh đó trƣởng thành, khụng cú khỏng thể cỳm và newcastle.
- Khỏng huyết thanh chuẩn:
+ Khỏng huyết thanh chuẩn trờn cỏc loài nhƣ thỏ, dờ, cừu… + Khỏng huyết thanh chế trờn gà.
* Cỏc trang thiết bị và cơ sở vật chất của phũng vi rỳt - Trung tõm Chẩn đoỏn Thỳ y, phũng vi rỳt - Trung tõm Kiểm nghiệm thuốc thỳ y Trung Ƣơng I.
2.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
- Thu thập số liệu về tỡnh hỡnh dịch bệnh cỳm gia cầm tại Thỏi Nguyờn qua cỏc năm 2010 - 2011.
- Giỏm sỏt huyết thanh năm 2010 và 2011: Làm phản ứng ngăn trở ngƣng kết hồng cầu (HI) để phỏt hiện khỏng thể khỏng vi rỳt cỳm subtyp H5 trong huyết thanh gia cầm, thủy cầm khụng tiờm phũng.
- Giỏm sỏt lƣu hành vi rỳt cỳm năm 2010 và 2011: Làm phản ứng RT-PCR phỏt hiện vi rỳt cỳm subtyp H5 trong mẫu dịch ngoỏy (swab) hầu họng và ổ nhớp của gia cầm, thủy cầm.
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn
56
- Làm phản ứng ngăn trở ngƣng kết hồng cầu (HI) để xỏc định hàm lƣợng khỏng thể khỏng vi rỳt cỳm subtyp H5 trong mẫu huyết thanh của gia cầm đó đƣợc tiờm phũng vaccine năm 2010 và 2011.
2.4.1. Phƣơng phỏp xử lý mẫu
Với gà, vịt cũn sống, mẫu bệnh phẩm đƣợc lấy là: dịch ngoỏy mũi; dịch ngoỏy họng; dịch ngoỏy khớ quản; dịch ngoỏy ổ nhớp; mẫu phõn; mỏu.
Đối với gà, vịt chết mẫu cần lấy là: khớ quản, dịch khớ quản; dịch rửa phế nang của phế quản; khớ quản, phổi; cỏc tổ chức phủ tạng khỏc: nóo, gan, lỏch, thận, tuyến tuỵ… Việc lấy mẫu phải đƣợc tiến hành đỳng lỳc, đỳng vị trớ, đỳng kỹ thuật. Cỏc mẫu dựng để phõn lập virus tốt nhất đƣợc lấy trong vũng 3 ngày đầu sau khi gia cầm cú biểu hiện triệu chứng bệnh cỳm.
Mẫu đƣợc giữ ở 40C và phải tiến hành phõn lập vi rỳt trong phạm vi 48 giờ kể từ khi lấy mẫu. Nếu cần bảo quản trong thời gian dài hơn thỡ phải giữ ở nhiệt độ -700
C.
Xử lý bệnh phẩm
a) Bệnh phẩm là dịch ngoỏy khớ quản, hậu mụn và phõn:
Bệnh phẩm đƣợc làm ấm, thờm khỏng sinh, lắc, trộn đều, để nhiệt độ phũng 30 phỳt, dịch ngoỏy hậu mụn và phõn cú thể lọc qua màng lọc, sau đú dựng để tiờm truyền.
b) Bệnh phẩm là tổ chức:
Nghiền mẫu bệnh phẩm (phổi, khớ quản, nóo…) trong PBS pH 7,2 thành huyễn dịch 10%. Ly tõm huyễn dịch 1000 vũng/phỳt trong 10 phỳt, thu dịch nổi. Bổ sung lƣợng khỏng sinh 10x
(đặc 10 lần) gồm Kanamycin, Penicillin, Streptomycin theo tỷ lệ 1/10 vào huyễn dịch bệnh phẩm trờn, để trong tủ lạnh 40C ớt nhất trong vũng 2 giờ để khỏng sinh diệt cỏc tạp trựng. Cỏc huyễn dịch bệnh phẩm nếu khụng đƣợc xử lý khỏng sinh thỡ cú thể lọc qua màng lọc 0,45àl hoặc 0,22àl. Huyễn dịch bệnh phẩm đó xử lý, nếu chƣa dựng phõn lập vi rỳt ngay thỡ cú thể giữ ở -700
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn
56
c) Bệnh phẩm là mỏu
Mỏu gia cầm đƣợc đựng trong ống ly tõm nhỏ (ống Eppendorf), ly tõm với tốc độ 1500 vũng trong 5 phỳt để tỏch riờng huyết thanh. Dựng pipette hỳt huyết thanh ở trờn đƣa sang ống khỏc. Huyết thanh này bảo quản ở +40
C và đƣợc dựng trong phản ứng HI, sau đú cú thể lƣu giữ ở - 300
C.
2.4.2. Phƣơng phỏp phỏt hiện khỏng nguyờn
2.4.2.1. Phõn lập vi rỳt trờn trứng cú phụi
- Chọn trứng cú phụi 9-10 ngày tuổi khoẻ mạnh, 3 trứng/bệnh phẩm. - Lau trứng bằng cồn 70% và đục lỗ nhỏ phớa trờn buồng hơi.
- Dựng syringe 1 ml lắp kim và hỳt dịch bệnh phẩm (đó xử lý ở trờn) tiờm vào xoang niệu mụ với lƣợng 0,2 ml/trứng.
- Ấp trứng tiếp 2-3 ngày ở nhiệt độ 370C.
- Theo dừi sau khi tiờm, soi trứng ngày 2 lần. Những trứng chết đƣợc cất vào tủ lạnh 40C để kiểm tra. Trứng chết hoặc sống đƣợc cất vào tủ lạnh 40C qua đờm hoặc ớt nhất 4 giờ trƣớc khi thu hoạch.
- Lau trứng bằng cồn 70%.
- Dựng panh và kộo vụ trựng cắt vỏ trứng, bộc lộ buồng hơi, gạt màng xoang niệu mụ sang bờn.
- Thu dịch niệu mụ vào ống nghiệm.
2.4.2.2. Kiểm tra nước trứng bằng phản ứng HA
- Nhỏ 25àl PBS 0,01M vào đĩa 96 giếng chữ V từ giếng thứ 1 đến giếng 12 của mỗi hàng.
- Cho 25 àl dịch niệu mụ vào giếng thứ 1.
- Pha loóng khỏng nguyờn bằng cỏch chuyển 25 àl dịch niệu mụ từ giếng thứ 1 sang giếng thứ 2 và tuần tự đến giếng 11 thỡ bỏ đi 50 àl .
- Nhỏ thờm 25 àl PBS vào cỏc giếng.
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn
56
- Lắc đĩa bằng mỏy hoặc bằng tay.
- Ủ đĩa phản ứng ở nhiệt độ phũng, thời gian khoảng 40 phỳt.
Đọc kết quả: Hiệu giỏ HA của vi rỳt đƣợc tớnh ở độ pha loóng khỏng nguyờn cao nhất cũn hiện tƣợng ngƣng kết hồng cầu.
- Nếu HA dƣơng tớnh, chứng tỏ cú vi rỳt. Tiếp tục giỏm định bằng phản ứng HI với khỏng huyết thanh chuẩn của một số subtyp H vi rỳt cỳm A và khỏng huyết thanh chuẩn Newcastle để xỏc định loại vi rỳt phõn lập.
- Nếu HA õm tớnh mà phụi chết, cú bệnh tớch phụi, lấy nƣớc trứng tiờm truyền lần 2.
- Nếu HA õm tớnh, phụi phỏt triển bỡnh thƣờng, cú thể tiờm lại hoặc khụng. - Bảo quản virus phõn lập đƣợc ở -700C.
2.4.2.3. Giỏm định vi rỳt phõn lập bằng phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu - HI - Pha khỏng nguyờn 4HA/25 àl: Lấy độ pha loóng cuối cựng cú phản ứng ngƣng kết hồng cầu chia cho 4.
Vớ dụ: Hiệu giỏ HA của dịch niệu mụ là 1/128. Đơn vị 4 HA = 128: 4 = 32.
Nhƣ vậy sẽ trộn 1 phần dịch nƣớc trứng với 31 phần PBS để đạt đƣợc dung dịch khỏng nguyờn 4HA.
- Chuẩn độ khỏng nguyờn 4 HA:
Sau khi pha, khỏng nguyờn 4HA phải đƣợc chuẩn độ lại. Tiến hành: Nhƣ phản ứng HA.
+ Pha chuẩn: Kết quả ngƣng kết xảy ra ở 2 giếng đầu. + Pha khụng chuẩn:
Khỏng nguyờn đặc: Nếu ngƣng kết đến giếng thứ 3 tức là thừa khỏng nguyờn. Nhƣ vậy, khỏng nguyờn 8HA phải đƣợc pha loóng (cú thể gấp đụi) để cú ngƣng kết đến giếng thứ 2.
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn
56
thiếu khỏng nguyờn, cú thể thờm một lƣợng khỏng nguyờn (bằng với lƣợng khỏng nguyờn pha ban đầu) để cú ngƣng kết đến giếng thứ 2.
- Tiến hành phản ứng HI: Trờn 1 đĩa cú thể tiến hành phản ứng HI với nhiều khỏng huyết thanh của cỏc subtyp khỏc nhau.
+ Nhỏ 25 àl PBS vào cỏc giếng của đĩa 96 giếng. + Nhỏ tiếp 25 àl khỏng huyết thanh vào giếng đầu tiờn.
+ Pha loóng khỏng huyết thanh theo cơ số 2, bằng cỏch chuyển 25 àl khỏng huyết thanh từ giếng 1 sang giếng 2 và tuần tự đến giếng 11 và bỏ đi 25 àl cuối cựng.
+ Nhỏ 25 àl khỏng nguyờn 4HA đó chuẩn bị vào cỏc giếng từ giếng 1 đến giếng 11. Thờm 25 àl PBS vào hàng đối chứng hồng cầu (giếng 12).
+ Lắc đĩa và ủ ở nhiệt độ phũng 30 phỳt.
+ Nhỏ 25 àl dung dịch hồng cầu vào tất cả cỏc giếng của đĩa, lắc đều.
Đọc kết quả:
- Phản ứng (+) dƣơng tớnh: Hồng cầu lắng xuống đỏy. Nhƣ vậy, vi rỳt phõn lập và khỏng huyết thanh chuẩn tƣơng ứng với nhau.
- Xỏc định subtyp: Một vi rỳt phõn lập đƣợc xỏc định subtyp khi nú phản ứng với một khỏng huyết thanh chuẩn hiệu giỏ cao hơn 4 lần so với cỏc khỏng huyết thanh chuẩn khỏc. Hiệu giỏ càng cao chứng tỏ sự tƣơng đồng của vi rỳt phõn lập với khỏng huyết thanh chuẩn càng lớn.
2.4.2.4. Phương phỏp RT-PCR
a. Chiết tỏch ARN từ mẫu dịch ngoỏy (Phương phỏp QiagenRNeasy)
- Lắc mạnh (bằng mỏy Vortex) ống chứa dịch ngoỏy và chuyển lƣợng 500 àl sang ống ly tõm nhỏ và ghi ký hiệu mẫu. Cho 500 àl Qiagen buffer RLT cú β-ME vào ống ly tõm trờn. Lắc đều bằng mỏy Vortex.
- Ly tõm (bằng mỏy Spindown) để dịch bệnh phẩm đọng trờn nắp trụi xuống đỏy ống. Cho 500 àl cồn ETOH 70% (ethanol), lắc mạnh bằng Vortex. Ly tõm mẫu đó bị dung giải trong 5 phỳt ở tốc độ 5000vg ở nhiệt độ phũng.
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn
56
- Chuyển tất cả dịch nổi chứa mẫu bị dung giải sang cột RNeasy
Qiagen đó ghi sẵn ký hiệu mẫu. Ly tõm trong 15 giõy tốc độ ≥8000vg ở nhiệt độ phũng. Kiểm tra dịch mẫu đó thấm qua cột lọc chƣa. Lặp lại bƣớc này cho đến khi toàn bộ mẫu đó qua cột lọc.
- Bổ sung 700 àl dung dịch rửa 1 (RW1 buffer) vào cột Rneasy Qiagen, ly tõm trong 15 giõy ở tốc độ ≥8000vg, thay ống thu mẫu mới (collection tube) vào cột lọc. Cho 500 àl RPE buffer vào cột RNeasy và ly tõm trong 15 giõy ở tốc độ ≥8000vg, thay ống thu mẫu mới vào cột lọc.
- Lặp lại bƣớc trờn 2 lần với dung dịch rửa RPE buffer. Sau lần rửa cuối cựng thay ống thu mẫu mới loại 2 ml vào cột lọc. Ly tõm cột lọc trống khụng trong 2 phỳt ở tốc độ tối đa (khoảng 12.000 vũng/phỳt), bỏ ống thu mẫu.
- Đặt cột lọc vào ống thu hoạch hoặc ống 1,5 ml đó đƣợc ghi sẵn ký hiệu mẫu. Cho 50 àl RNase free H2O vào cột lọc. Chỳ ý khụng đƣợc chạm đầu tip vào mặt thạch Silica trong cột lọc. Ủ ở nhiệt độ phũng trong ớt nhất 1 phỳt. Tỏch ARN bằng cỏch ly tõm cột trong 1 phỳt ở 10.000 vũng/phỳt. Bỏ cột lọc RNeasy.
- Bảo quản mẫu ARN thu đƣợc ở 40C trong thời gian ngắn trƣớc khi làm RT-PCR. Nếu làm sau 24 giờ, mẫu nờn bảo quản ở -200C hoặc nhiệt độ thấp hơn.
b. Tiến hành phản ứng RT-PCR * Dụng cụ:
- Ống 25 àl Smart Cycler (catalog 900-0022 hoặc 900-0003, Cepheid Smart Cycler, Sunnyvale, CA).
- Giỏ ống phản ứng PCR làm lạnh đƣợc và mỏy li tõm ống nhỏ . Cả 2 thiết bị này đƣợc cung cấp kốm theo hệ thống mỏy Smart Cycler hệ thống bơm hỳt chõn khụng 24 van QiaVac cú khả năng hỳt 18-20 lớt/phỳt.
* Nguyờn liệu:
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn
56
- ARN đối chứng dƣơng tớnh M, H5 và H7 (đƣợc NVSL cung cấp). - Cồn tuyệt đối.
- Isopropanol, 99+% tinh khiết. - Chloroform, 99+% tinh khiết. - Trizolđ LS reagent.
2.4.3. Xử lý số liệu
Số liệu đƣợc xử lý theo phƣơng phỏp thống kờ sinh vật học bằng chƣơng trỡnh Microsoft Excel.
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn
56
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ CỦA BỆNH CÚM GIA CẦM Ở TỈNH THÁI NGUYấN THÁI NGUYấN
3.1.1. Tỡnh hỡnh bệnh cỳm gia cầm từ năm 2008 đến nay
Chỳng tụi đó tiến hành điều tra tỷ lệ gia cầm mắc bệnh cỳm H5N1 của tỉnh Thỏi Nguyờn từ năm 2008 đến thời điểm thỏng 10 năm 2011. Kết quả điều tra đƣợc thể hiện qua Bảng 3.1.
Bảng 3.1. Tỷ lệ gia cầm mắc bệnh cỳm tỡnh từ năm 2008- 2011
Năm Tổng số gia cầm của năm (con)
Số gia cầm mắc bệnh (con) Tỷ lệ mắc (%) 2008 7.574.496 6.752 0,08 2009 10.075.676 16.863 0,17 2010 14.895.423 7.089 0,048 2011 12.876.436 6.456 0,05 Tổng 45.422.031 37.160 0,081
Tại tỉnh Thỏi Nguyờn, dịch cỳm ra cầm bắt đầu xảy ra cựng với dịch cỳm trong phạm vi toàn quốc. Dịch xảy ra rải rỏc từ năm 2008 đến nay. Dịch bắt đầu xảy ra mạnh từ đầu năm 2009, dịch xảy ra bất ngờ làm cho số gia cầm bị chết và tiờu huỷ là 16.863 con chiếm 0,17% số gia cầm trờn địa bàn của tỉnh. Từ khi dịch xảy ra, Bộ Nụng Nghiệp và Phỏt triển Nụng thụn đó tớch cực đề ra cỏc biện phỏp phũng và chống bệnh. Trong đú, biện phỏp tớch cực nhất là tiờm phũng và vệ sinh phũng bệnh. Tuy nhiờn vẫn khụng thanh toỏn đƣợc bệnh vỡ đõy là một bệnh truyền nhiễm cú tớnh chất lõy lan nhanh. Đến năm 2010 dịch lại bựng phỏt trở lại, số gia cầm bị mắc bệnh và chết là 7.089 con, chiếm tỷ lệ 0,048%. Trong đợt dịch này, do đó cú sự chủ động trong phũng bệnh nờn số gia cầm bị mắc bệnh và chết cũng ớt hơn so với năm 2009. Và đến năm 2011, dịch lại xảy ra làm cho số gia cầm bị mắc bệnh và tiờu huỷ là 6.456 con (chiếm tỷ lệ 0,05%).
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn
56
Nhƣ vậy, nhỡn tổng quan từ năm 2008 đến nay, toàn tỉnh Thỏi Nguyờn đó xảy ra 4 đợt dịch cỳm gia cầm (năm 2008- đầu 2009; 2010 và năm 2011). Trong đú, đợt dịch đầu 2009 xảy ra nặng nề nhất. Vỡ số gia cầm bị mắc bệnh và buộc phải tiờu huỷ là lớn nhất. Do dịch xảy ra bất ngờ nờn cỏc địa phƣơng khụng kịp đề ra biện phỏp đối phú kịp thời. Những đợt dịch về sau do cú kinh nghiệm và chủ động trong việc dập dịch nhƣ: vệ sinh, phun thuốc sỏt trựng chuồng, nghiờm cấm vận chuyển lƣu thụng gia cầm từ vựng cú dịch sang cỏc vựng khỏc trong tỉnh. Vỡ vậy, khi dịch vừa xảy ra đó tổ chức tiờu diệt toàn bộ gia cầm trong ổ dịch và dập ngay dịch, khụng để dịch khỏc lõy lan. Mặt khỏc, do chỳng ta đó làm tốt cụng tỏc tuyờn truyền để ngƣời dõn để biết đƣợc cỏc biểu hiện của bệnh, tớnh chất nguy hiểm của bệnh vỡ bệnh lõy lan sang ngƣời. Do đú, ngƣời dõn cú ý thức cao, khi phỏt hiện ra bệnh xảy ra ở gia cầm là bỏo ngay cho cơ quan thỳ y để cú biện phỏp xử lý kịp thời, đồng thời ngƣời chủ nuụi cú ý thức tốt hơn trong việc thực hiện tiờm phũng cho đàn gia cầm tại gia đỡnh.
3.1.2. Biến động tỷ lệ bệnh cỳm gia cầm theo mựa
Để hiểu rừ hơn về đặc điểm dịch tễ của bệnh cỳm gia cầm, chỳng tụi đó