II. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1. Phương pháp lấy mẫu nước tiểu:
Mẫu nước tiểu được lấy khi có chỉ định cấy nước tiểu của bác sĩ lâm sàng. Các thao tác lấy nước tiểu do người được phân công lấy hoặc do bệnh nhân tự lấy theo hướng dẫn.
1.1. Thời điểm lấy nước tiểu:
Thời điểm lấy nước tiểu tốt nhất là buổi sáng. Nước tiểu phải được lấy trước khi bệnh nhân sử dụng kháng sinh; trường hợp đã sử dụng phải báo cho bác sĩ biết để có hướng xử lý thích hợp.
2.2. Cách lấy mẫu nước tiểu:
Nước tiểu phải được lấy bằng phương pháp vô khuẩn, tránh tối đa tạp nhiễm từ các cơ quan sinh dục ngoài. Mẫu nước tiểu được chứa trong lọ vô khuẩn, có nắp đậy chặt. Mẫu được chuyển ngay đến Đơn vị Vi sinh – Sinh học phân tử để thực hiện khảo sát.
2.2.1. Cách lấy nước tiểu “giữa dòng” ở nam:
-Vệ sinh tay kỹ với xà bông, lau khô tay bằng khăn sạch. -Cởi quần, kéo phần da bao quy đầu tụt ra sau.
-Rửa sạch bộ phận sinh dục với xà bông, thấm khô bằng gạc vô khuẩn. -Tiểu bỏ phần đầu, lấy phần nước tiểu còn lại vào lọ đựng mẫu.
2.2.2. Cách lấy nước tiểu “giữa dòng” ở nữ:
-Vệ sinh tay kỹ với xà bông, lau khô tay bằng khăn sạch.
-Cởi quần, vạch âm môi, rửa sạch bộ phận sinh dục với xà bông, thấm khô bàng gạc vô khuẩn. Trong suốt quá trình không để âm môi đụng vào bên trong.
-Tiểu bỏ phân đầu, lấy phần nước tiểu còn lại vào lọ đựng mẫu.
2.2.3. Cách lấy nước tiểu “giữa dòng” ở trẻ em:
-Cho trẻ uống thật nhiều nước trước khi lấy nước tiểu.
-Cho trẻ ngồi trên đùi phụ huynh, rửa sạch bộ phận sinh dục với xà bông, thấm không bằng gạc vô khuẩn.
-“Xi” cho trẻ tiểu và hứng lấy càng nhiều nước tiểu càng tốt.
2.2.4. Cách lấy nước tiểu bằng phương pháp khác:
-Chọc qua da trên xương mu. -Dùng ống thông tiểu.
-Bằng kỹ thuật nội soi bàng quang. 2. Khảo sát trực tiếp mẫu nước tiểu[4]:
Khảo sát trực tiếp mẫu nước tiểu bằng cách nhuộm Gram (theo phương pháp Hucker cải tiến).
Tiến hành phết lame và cố định mẫu trong tủ an toàn sinh học. Nhỏ một giọt nước tiểu lên lame hoặc dùng que cấy thường lấy mẫu nước tiểu lên lame, dàn đều mẫu và để khô tự nhiên để cố định mẫu lên lame.
Đặt tiêu bản lên giá đỡ trong bồn nhuộm Gram và nhuộm Gram theo qui trình sau: -Bước 1: Nhuộm tiêu bản với Crystal violet bằng cách nhỏ dung dịch lên mẫu đã cố định trên lame. Chờ 60 giây sau đó rửa sạch bằng nước cất và thấm khô.
-Bước 2: Nhuộm lại mẫu với dung dịch Lugol. Chờ 60 giây sau đó rửa sạch bằng nước cất và thấm khô.
-Bước 3: Tẩy màu bằng dung dịch tẩy màu trong 30 giây (vừa khi thấy mất màu). Rửa lại bằng nước và thấm khô.
-Bước 4: Nhuộm bổ sung bằng dung dịch Safranin. Chờ 60 giây sau đó rửa lại bằng nước cất và thấm khô.
Hình 2.5: Vi khuẩn bắt màu qua mỗi bước nhuộm Gram. (Nguồn Internet)
Tiêu bản sau khi nhuộm được quan sát dưới kính hiển vi bằng vật kính dầu. Tìm trên tiêu bản trực khuẩn Gram âm, là các vi khuẩn dạng que (trực) và bắt màu Gram âm (là
các vi khuẩn bắt màu hồng hoặc đỏ). Đồng thời khảo sát đánh giá tình trạng nhiễm khuẩn của bệnh nhân:
Nếu có ít nhất 01 tế bào vi khuẩn và/hay bạch cầu diện diện trên một quang trường, có thể nghi ngờ bệnh nhân bị nhiễm khuẩn đường tiết niệu. Ghi nhận mẫu này để tiến hành các khảo sát tiếp theo.
3. Cấy định lượng mẫu nước tiểu[4]:
Mẫu nước tiểu trước khi cấy được lắc để trộn đều, giúp vi khuẩn phân bố đều trong mẫu. Dùng que cấy định lượng đường kính khuyên cấy đường kính 1mm (1/1000 ml) lấy một vòng khuyên mẫu nước tiểu. Trải đều mẫu trên bề mặt môi trường nuôi cấy: BA và MC bằng kỹ thuật cấy “hàng rào”. Ủ các đĩa môi trường vào tủ ấm ở 35-37 0C trong thời gian 18-24 giờ.
Đọc kết quả cấy nước tiểu bằng cách đếm số khuẩn lạc mọc trên đĩa môi trường nuôi cấy, từ đó suy ta số lượng vi khuẩn trong mầm cấy ban đầu. Đánh giá mức độ nhiễm khuẩn đường tiết niệu bằng lượng vi khuẩn sống (Colony Forming Unit – CFU) trong 1ml nước tiểu
Nếu có:
-≤ 10 000 CFU/ml nước tiểu, không có nhiễm khuẩn đường tiết niệu. -≥ 100 000 CFU/ml nước tiểu, chắc chắn nhiễm khuẩn đường tiết niệu.
-Trường hợp còn lại chỉ nghi ngờ nhiễm khuẩn đường tiết niệu. Nếu bệnh nhân có triệu chứng lâm sàng chắc chắn nhiễm khuẩn đường tiết niệu hoặc bị nhiễm khuẩn đường tiết niệu tái đi tái lại nhiều lần, có thể định danh vi khuẩn phân lập được và tiến hành làm kháng sinh đồ.
4. Phương pháp phân lập và định danh:
Các mẫu nước tiểu dương tính (có vi khuẩn mọc) khi cấy định lượng cũng được xem là kết quả phân lập vi khuẩn trong nước tiểu. Các vi khuẩn này được tiến hành định danh bằng bộ KIT định danh vi khuẩn API 10S của Biomérieux.
4.1. Chuẩn bị:
-Mẫu cấy dương tính.
-Nước muối sinh lý vô trùng. -Bơm tiêm vô trùng.
-Tube đựng huyền dịch vi khuẩn (loại 5 ml). -Bộ định danh API 10S của Biomérieux. -Giá đỡ.
4.2. Các bước tiến hành:
Toàn bộ các thao tác trong quá trình này đều được thực hiện trong tủ an toàn sinh học với điều kiện vô trùng, và theo hướng dẫn kèm theo trong mỗi bộ sản phẩm API 10S.
4.2.1. Pha huyền dịch vi khuẩn:
Cho vào tube đựng khoảng 3-5 ml nước muối sinh lý. Chọn khuẩn lạc điển hình mọc trên môi trường MC. Dùng que cấy thường lấy một lượng vi khuẩn từ khuẩn lạc vừa đủ hoà tan vào dịch nước muối sinh lý nói trên để được huyền dịch vi khuẩn. Lắc để vi khuẩn phân bố đều trong huyền dịch.
4.2.2. Thao tác với bộ KIT API 10S:
-Dùng bơm tiêm vô khuẩn hút huyền dịch vi khuẩn và nạp vào các giếng của bộ KIT theo hướng dẫn:
+Đối với các giếng thử nghiệm ONPG, GLU, ARA, LDC, ODC, H2S, URE, TDA, IND, huyền dịch vi khuẩn chỉ được bơm đến miệng của mỗi giếng.
+Đối với giếng CIT, huyền dịch vi khuẩn phải được bơm đầy vào giếng.
+Đối với thử nghiệm OX, nhỏ trực tiếp huyền dịch vi khuẩn lên đĩa giấy Oxidase và đọc kết quả.
-Đối với các giếng LDC, ODC, H2S, URE, sau khi nạp huyền dịch vi khuẩn, nhỏ thêm lớp dầu khoáng vào mỗi giếng cho đến khi lấp hết phần trống còn lại ở miệng mỗi giếng.
4.2.3. Đọc kết quả định danh vi khuẩn bằng bộ KIT API 10S:
Kết quả định danh vi khuẩn được đọc theo hướng dẫn kèm theo trong mỗi bộ KIT. Trước khi đọc kết quả cần nhỏ các thuốc thử vào các giếng như sau:
-TDA: Nhỏ một giọt TDA vào giếng thử nghiệm TDA. -IND: Nhỏ một giọt JAMES vào giếng thử nghiệm IND.
-NO2: Nhỏ một giọt NIT 1 và một giọt NIT 2 vào giếng thử nghiệm GLU (sau khi đã ghi nhận kết quả thử nghiệm GLU). Chờ khoảng 2 đến 5 phút. Màu đỏ xuất hiện trong giếng được ghi nhận là dương tính.
Kết quả thử nghiệm sinh hoá âm tính:
Hình 2.7: Kết quả thử nghiệm sinh hoá âm tính của bộ KIT API 10S (Biomérieux). Kết quả thử nghiệm sinh hoá dương tính:
Hình 2.8: Kết quả thử nghiệm sinh hoá dương tính của bộ KIT API 10S (Biomérieux).
5. Kháng sinh đồ và khảo sát khả năng sinh ESBL:
Trong nghiên cứu này, các khảo nghiệm với kháng sinh được thực hiện bằng kỹ thuật Kirby Bauer và biện luận theo CLSI.
5.1. Phương pháp đặt kháng sinh đồ:
5.1.1. Chuẩn bị:
-Nước muối sinh lý
-Ống độ đục chuẩn 0,5 McFarland -Que cấy thường
-Đèn bunsen. -Que gòn.
-Môi trường MHA, đĩa 90 mm. -Bộ đĩa giấy tẩm kháng sinh. -Kẹp gắp.
5.1.2. Pha huyền dịch vi khuẩn:
Cho 1 ml dung dịch nước muối sinh lý vào tube đựng. Chọn trên đĩa thạch MC các khuẩn lạc đặc trưng, dùng que cấy thường bắt lấy các khuẩn lạc này với lượng vừa đủ và hoà tan vào dung dịch nước muối sinh lý nói trên. Lắc tube để vi huẩn phân bố đều trong huyền dịch. Điều chỉnh độ đục của huyền dịch vi khuẩn bằng ống chuẩn độ đục 0,5 McFarland.
5.1.3. Trải huyền dịch vi khuẩn lên bề mặt thạch MHA:
Sử dụng que gòn vô khuẩn nhúng vào huyền dịch vi khuẩn nói trên, ép và xoay nhẹ que gòn trên thành tube đựng để loại bỏ lượng huyền dịch thừa ra khỏi que gòn.
Tiến hành trải vi khuẩn ở que gòn lên lặt thạch MHA bằng cách vạch đều tay que gòn lên mặt thạch, vừa vạch vừa xoay nhẹ que gòn để lấy được nhiều nhất vi khuẩn lên mặt thạch. Xoay đĩa thạch 900 và làm như trên, xoay đĩa thạch 450 và làm tương tự một lần nữa.
Để cho mặt thạch khô và tiếp tục đặt đĩa kháng sinh đồ.
5.1.4. Đặt đĩa kháng sinh lên mặt thạch đã trải vi khuẩn:
Bộ đĩa kháng sinh sử dụng trong nghiên cứu này bao gồm:
-Bộ thử nghiệm sàng lọc ESBL: Cefotaxime, cetriaxone, ceftazidime.
-Bộ thử nghiệm khẳng định ESBL: Cefotaxime và cefotaxime + clavulanic acid, ceftazidime và ceftazidime + clavulanic acid.
-Bộ thử nghiệm đề kháng kháng sinh: Amikacin, tobramycin, imipenem, ertapenem, meropenem, cefotaxime, ceftazidime, ceftriaxone, cefepime, moxifloxacin, ciprofloxacin, nalidixic acid, nitrofurantoin. Các kháng sinh này được chọn lựa theo các phân nhóm xác định: aminoglycoside, carbapenem, cephem, fluoroquinolone, và nhóm bắt buộc cho bệnh phẩm nước tiểu. Việc lựa chọn như vậy nhằm mục đích khảo sát thêm tương tác của trực khuẩn sinh ESBL với các phân nhóm nói trên.
Sử dụng kẹp gắp các đĩa giấy tẩm kháng sinh từ ống đựng và đặt lên mặt thạch sao cho không để đầu kẹp chạm vào mặt thạch (nếu chạm phải đốt hơ nóng đầu kẹp trước khi tiếp tục thao tác). Dùng đầu kẹp đè nhẹ trên đĩa kháng sinh cho đĩa tiếp xúc hoàn toàn với mặt thạch. Kháng sinh sẽ khuếch tán ra xung quanh ngay khi vừa chạm mặt thạch.
Tâm các đĩa kháng sinh cách nhau và cách mép hộp thạch tối thiểu 25 mm. Chỉ đặt 7 đĩa kháng sinh trên một hộp thạch.
Sau tất cả các thao tác trên của kỹ thuật, các hộp thạch đã làm kháng sinh đồ được đem ủ trong tủ ấm ở 360C ± 2 0C từ 18 giờ đến 24 giờ.
Sau thời gian ủ trong điều kiện nói trên, đánh giá mức độ nhạy cảm của vi khuẩn đối với các loại kháng sinh được bằng cách đo đường kính vùng ức chế trên mặt thạch của mỗi loại kháng sinh và biện luận theo CLSI. (Sử dụng thước có độ chia nhỏ nhất 1mm để đo đường kính vùng ức chế và so sánh với giới hạn đường kính vùng ức chế ở phần phụ lục để đánh giá mức độ nhạy cảm của mỗi loại kháng sinh theo ba mức: nhạy cảm, trung tính, kháng)
Hình 2.9: Kháng sinh đồ của một mẫu bệnh phẩm trong nghiên cứu.
5.2. Phương pháp thử nghiệm phát hiện trực khuẩn Gram âm sinh ESBL[11]: Các thử nghiệm phát hiện trực khuẩn Gram âm sinh ESBL được tiến hành và biện luận theo hướng dẫn của Viện Tiêu chuẩn Lâm sàng và Xét nghiệm (Clinical and Laboratory Standards Institute – CLSI), cập nhật tháng 01 năm 2013.
Trong nghiên cứu này, thử nghiệm phát hiện ESBL được tiến hành theo hai bước gồm: thử nghiệm phát hiện sàng lọc và thử nghiệm khẳng định.
5.2.1. Thử nghiệm sàng lọc:
- Đối với K. pneumoniae, K. oxytoca, và E. coli: +Cefpodoxime 10 μg hoặc +Ceftazidime 30 μg hoặc +Aztreonam 30 μg hoặc +Cefotaxime 30 μg hoặc +Ceftriaxone 30 μg. - Đối với P. mirabilis:
+Cefpodoxime 10 μg hoặc +Ceftazidime 30 μg hoặc +Cefotaxime 30 μg
(Sử dụng hơn một kháng sinh với xét nghiệm sàng lọc giúp tăng độ nhạy phát hiện)
Bộ đĩa kháng sinh thử nghiệm sàng lọc trong nghiên cứu này gồm: Cefotaxime, cetriaxone, ceftazidime. Các thao tác được thực hiện bình thường như trên.
Vi khuẩn có kết quả thử nghiệm sàng lọc ESBL dương tính khi đường kính vùng ức chế của cefotaxime, ceftriaxone, ceftazidime lần lượt nhỏ hơn 27 mm, 25 mm, 22 mm. Trong thử nghiệm này, chỉ cần một trong các kháng sinh sử dụng cho kết quả thoả điều kiện trên đều được ghi nhận là dương tính.
5.2.2. Thử nghiệm khẳng định:
Trong nghiên cứu này, thử nghiệm khẳng định ESBL được tiến hành theo phương pháp đĩa kết hợp theo hướng dẫn của CLSI.
Các chủng dương tính trong thử nghiệm sàng lọc được tiếp tục làm thử nghiệm khẳng định ESBL. Trong thử nghiệm này sử dụng hai cặp đĩa kháng sinh gồm: Cefotaxime 30μg và cefotaxime + clavulanic acid 30/10 μg, ceftazidime 30 μg và ceftazidime + clavulanic acid 30/10 μg. Thử nghiệm khẳng định ESBL yêu cầu sử dụng cả cefotaxime và ceftazidime, đơn độc hoặc phối hợp với clavulanic acid. Các thao tác được thực hiện bình thường như trên.
Clavulanic acid là sản phẩm do sự lên men của Streptomyces clavuligerus, có cấu trúc β-lactam gần giống với penicilin, có khả năng ức chế β-lactamase do phần lớn các vi khuẩn Gram âm và Staphylococcus sinh ra. Ðặc biệt nó có tác dụng ức chế mạnh các β- lactamase truyền qua plasmid gây kháng các penicilin và các cephalosporin. Bản thân clavulanic acid kháng khuẩn rất yếu, tuy nhiên khi kết hợp với một kháng sinh nhóm β- lactam nó có tác dụng bảo vệ kháng sinh này không bị phân huỷ bởi β-lactamase và giúp mở rộng phổ tác dụng của các kháng sinh này.
Vi khuẩn có kết quả thử nghiệm khẳng định ESBL dương tính khi tăng đường kính vùng ức chế ≥ 5 mm đối với một kháng sinh khi phối hợp với clavulanic acid so với đường kính vùng ức chế khi dùng kháng sinh đó đơn. Trong thử nghiệm này, bắt buộc cả hai cặp đĩa kháng sinh sử dụng cho kết quả cùng thoả điều kiện trên thì mới được ghi nhận là dương tính.
PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
I. MẪU NƯỚC TIỂU VÀ TRỰC KHUẨN GRAM ÂM 1. Mẫu nước tiểu: 1. Mẫu nước tiểu:
Từ tháng 11 năm 2013 đến tháng 05 năm 2014, tổng cộng đã có 1122 mẫu của 1122 bệnh nhân được chỉ định cấy nước tiểu tại Bệnh viện nhân dân 115. Trong đó, có 261 mẫu nước tiểu của 261 bệnh nhân cho kết quả nuôi cấy dương tính (bệnh nhân bị nhiễm khuẩn đường tiết niệu), chiếm tỷ lệ 23,26%. Tỷ lệ vi khuẩn mọc thấp như trên được giải thích do các chỉ định cấy nước tiểu này đều dựa trên các triệu chứng lâm sàng của bệnh nhân hoặc sự nghi ngờ của bác sĩ thăm khám. Do đó việc kết luận bệnh nhân có bị nhiễm khuẩn đường tiết niệu hay không dựa trên các triệu chứng lâm sàng là chưa hoàn toàn chính xác và đầy đủ mà cần được khẳng định bằng kết quả cấy nước tiểu.
Hình 3.1: Biểu đồ tỷ lệ mẫu cấy dương tính và tỷ lệ giới tính bệnh nhân.
Trong số các bệnh nhân cho kết quả cấy nước tiểu dương tính có 93 mẫu là của bệnh nhân nam (chiếm 35,63%) và 168 mẫu là của bệnh nhân nữ (chiếm 64,37%). Kết quả này cho thấy tỷ lệ mắc bệnh ở nữ giới cao hơn so với nam giới, tỷ lệ này phù hợp với các thống kê chung trong các nghiên cứu trên thế giới [1, 7, 13, 15]. Điều này có thể giải thích do cấu tạo cơ quan tiết niệu ở phụ nữ nằm ở gần cơ quan sinh dục và hậu môn, đồng thời niệu đạo ngắn, vệ sinh khó khăn,… do đó khiến nữ giới dễ bị nhiễm khuẩn đường tiết niệu hơn. Bên cạnh đó sinh lý nữ: giai đoạn kinh nguyệt, dịch tiết của âm đạo,… cũng là nguyên nhân thuận lợi góp phần gây nhiễm khuẩn đường tiết niệu ở nữ.
Các bệnh nhân có mẫu nuôi cấy dương tính trong nghiên cứu này có độ tuổi phân bố từ 17 tuổi đến 99 tuổi; ngoài ra có 3 bệnh nhân không rõ tuổi. Tỷ lệ theo độ tuổi của các