1. Địa điểm và thời gian tiến hành thí nghiệm: 1.1. Địa điểm: 1.1. Địa điểm:
Đơn vị Vi sinh – Sinh học phân tử, Khoa Xét nghiệm, Bệnh viện nhân dân 115. 527 Sư Vạn Hạnh nối dài, Phường 12, Quận 10, Thành phố Hồ Chí Minh. 1.2. Thời gian:
Từ tháng 11 năm 2013 đến tháng 05 năm 2014 (06 tháng). 2. Thiết bị và dụng cụ:
2.1. Thiết bị:
- Tủ an toàn sinh học cấp 2 Airstream của ESCO. - Đèn Bunsen của Electrothermal.
- Tủ ấm nuôi cấy vi khuẩn INCUCELL 222 của MMM Group. - Kính hiển vi CX21 của Olympus.
- Bồn nhuộm Gram.
Hình 2.1: Tủ an toàn sinh học cấp 2 Airstream của ESCO và kính hiển vi CX21 của Olympus. (Nguồn: Internet)
Hình 2.2:Tủ ấm nuôi cấy vi khuẩn INCUCELL 222 của MMM Group (Nguồn:Internet) và đèn Bunsen của Electrothermal.
2.2. Dụng cụ:
Lọ đựng mẫu nước tiểu, que cấy (que cấy thường, que cấy định lượng), lame kính và lamen, đĩa petri đường kính 90 mm, kẹp gắp, que gòn làm kháng sinh đồ,…
3. Hoá chất:
3.1. Bộ nhuộm Gram:
Bộ nhuộm Gram bao gồm: Crystal violet, lugol, safranin, dung dịch tẩy màu. (Theo phương pháp Huck cải tiến).
3.1.1. Dung dịch Tím kết tinh (Crystal violet):
-2 g tím kết tinh hoà tan trong 20 ml etanol 95 %. -0,8 g ammon oxalate hoà tan trong 80 ml nước cất.
Trộn hai dịch nói trên lại với nhau, giữ 48 giờ rồi lọc. Bảo quản trong lọ tối, sử dụng vài tháng.
3.1.2. Dung dịch lugol:
Hoà tan 1 g Iod (Iodine) trong 3-5 ml nước cất, thêm 2 g KI (Kali iodide), khuấy cho tan hết, thêm nước cất cho đủ 300 ml. Bảo quản trong lọ tối.
3.1.4. Safranin:
Chuẩn bị sẵn dung dịch Safranin O 2,5 %, trước khi dùng pha với nước cất theo tỷ lệ 1:5 để có dung dịch 0,5 %.
3.2. Môi trường thạch máu (Blood Agar – BA):
Môi trường do Công ty TNHH Nam Khoa sản xuất và cung cấp.
Công thức môi trường*:
Pepton……… 10 g NaCl………..……… 5 g Cao thịt……….. 4 g Thạch………. 20 g Nước cất……… 1000 ml
Máu thỏ hoặc máu cừu………. 50 ml (Máu 5%)
*Theo Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương.
3.3. Môi trường MacConkey (MC):
Môi trường do Công ty TNHH Nam Khoa sản xuất và cung cấp. Công thức môi trường*:
Thạch MacConkey……… 50g
Nước cất……… 1000ml
*Theo Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương.
3.4. Môi trường thạch Mueller-Hinton (MHA):
Môi trường do Công ty TNHH Nam Khoa sản xuất và cung cấp. Công thức môi trường*:
Cao thịt……….. 2 g Casein thuỷ phân………... 17,5 g Tinh bột………. 17 g Nước cất……… 1000 ml
Hình 2.3: Môi trường BA, MC và MHA.
3.5. Bộ KIT định danh vi khuẩn API(Analytical Profile Index)10S [16]:
Hình 2.4: Bộ KIT API 10S.
Bộ KIT định danh API 10S được chỉ định định danh cho các Enterobacteriaceae và các trực khuẩn Gram âm khác.
Bộ API 10s là một khay nhựa, bao gồm 10 giếng nhỏ chứa các cơ chất đã được đông khô. Mỗi giếng nhằm kiểm tra một hay nhiều đặc điểm sinh hoá khác nhau. Cụ thể:
-ONPG: Kiểm tra sự hiện diện của enzyme β-galactosidase. -GLU: Kiểm tra khả năng lên men đường glucose.
-LDC: Kiểm tra phản ứng decarboxylation của các amino acid lysine bởi lysine decarboxylase.
-ODC: Kiểm tra phản ứng decarboxylation của các amino acid ornithine bởi ornithine decarboxylase.
-CIT: Kiểm tra khả năng sử dụng citrate như là nguồn carbon duy nhất. -H2S: Kiểm tra khả năng sinh hydrogen sulfide.
-URE: Kiểm tra khả năng sinh enzyme urease.
-TDA: Phát hiện sự hiện diện của enzyme tryptophan deaminase.
-IND: Kiểm tra khả năng sinh indol từ tryptophan nhờ enzyme tryptophanase. Ngoài ra, kiểm tra sự hiện diện của cytochrome oxidase được thực hiện bằng một phản ứng riêng biệt và không có trên khay của bộ KIT API 10S.
3.6. Kháng sinh:
Kháng sinh sử đụng trong nghiên cứu này được trình bày ở “Danh mục từ viết tắt”. 4. Nguyên liệu:
4.1. Mẫu nước tiểu:
Mẫu nước tiểu dùng trong nghiên cứu này là mẫu lấy từ bệnh nhân có chẩn đoán nhiễm khuẩn đường tiết niệu, được chỉ định cấy nước tiểu và thực hiện kháng sinh đồ từ tháng 11 năm 2013 đến tháng 05 năm 2014.
Mẫu được lấy tại Bệnh viện nhân dân 115. 4.2. Trực khuẩn Gram âm:
Kết quả khảo sát, nuôi cấy, phân lập và định danh từ các mẫu nước tiểu nói trên là trực khuẩn Gram âm.
Toàn bộ quy trình được thực hiện tại Đơn vị Vi sinh – Sinh học phân tử, Khoa Xét nghiệm, Bệnh viện nhân dân 115.