3.5. Xác định liều xâm nhiễm tối ưu của virus NIBRG-121xp-E1
3.6. Khảo sát thời gian bám và tăng trưởng của tế bào MDCK trên vi hạt Cytodex1 hạt Cytodex1
3.7. Ứng dụng các điều kiện nuơi cấy thích hợp đã được khảo sát để nuơi cấy virus NIBRG-121xp-E1 bằng vi hạt Cytodex1 nuơi cấy virus NIBRG-121xp-E1 bằng vi hạt Cytodex1
3. Kết quả - Biện luận 36
3.1. Xây dựng đường cong tăng trưởng của tế bào MDCK trong mơi trường M0643 [5% CO2, 10% FBS]
3.1.1. Mục đích thí nghiệm
Xác định các pha tăng trưởng, tốc độ tăng trưởng và thời gian nhân đơi quần thể của tế bào MDCK khi nuơi cấy trong mơi trường M0643 với 10% FBS, 5% CO2, 37oC, pH 7,2–7,4 để làm cơ sở cho các thí nghiệm tiếp sau.
3.1.2. Mơ tả thí nghiệm
Từ ngân hàng tế bào trữ trong Nitơ lỏng -196oC, tế bào MDCK được rã đơng và cấy chuyền 3 đời trên mơi trường M0643, 10%FBS, 5%CO2, 37oC, pH 7,2–7,4 (sử dụng flask T25cm2) để tế bào thích ứng và sinh trưởng ổn định.
Sau đĩ, tiếp tục sử dụng mơi trường nĩi trên, tế bào MDCK được cấy chuyền sang các plate 12 giếng với mật độ là 2x105tế bào/giếng và thể tích mơi trường nuơi cấy là 2ml/giếng.
Đường cong tăng trưởng của tế bào MDCK được xây dựng thơng qua việc xác định số lượng tế bào theo thời gian: mỗi ngày đếm số tế bào sống ở 1 giếng và giá trị được thể hiện là giá trị trung bình của 4 lần đếm.
3.1.3. Kết quả – Biện luận
Dựa vào đồ thị đường cong tăng trưởng của tế bào MDCK trong mơi trường M0643 [5% CO2, 10% FBS] (Hình 3.1), các pha tăng trưởng của tế bào MDCK được ngoại suy như sau:
• Từ 0 giờ đến 18 giờ: pha tiềm tàng. Tế bào thích ứng với mơi trường mới, bám dính vào bề mặt nuơi cấy và bắt đầu trải rộng.
• Từ 18 giờ đến 108 giờ: pha tăng trưởng. Tế bào sinh trưởng mạnh và số lượng tế bào tăng lên theo cấp số nhân.
• Sau 108 giờ: pha ổn định và suy tàn. Tế bào phủ kín bề mặt nuơi cấy. Tốc độ tăng trưởng giảm dần, số tế bào chết đi nhiều hơn số tế bào mới sinh ra nên tổng số tế bào giảm dần.
0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00
ngày 0 ngày 1 ngày 2 ngày 3 ngày 4 ngày 5 ngày 6 ngày 7 Thời gian T ổ ng s ố t ế b ào ( x10 5 ) NH = 1,9x106 NI = 0,3x106 t1 = 18 giờ t2 = 108 giờ
Hình 3.1.Đường cong tăng trưởng của tế bào MDCK trong mơi trường M0643. [5% CO2, 10% FBS]
Theo đĩ, các thơng số về đặc điểm tăng trưởng của tế bào MDCK trong mơi trường M0643 [5% CO2, 10% FBS] cũng được xác định:
• Tốc độ phân chia: r = [3,32 x (logNH – logNI)] / (t2 – t1) = 0,0296 (tế bào/giờ)
• Thời gian nhân đơi quần thể: T = 1/r = 33,78 (giờ)
Khi bắt đầu tiến hành nuơi cấy 1 dịng tế bào thì việc xây dựng đường cong tăng trưởng, xác định các pha tăng trưởng cũng như các thơng số về đặc điểm tăng trưởng của tế bào được thực hiện nhằm đánh giá khả năng thích ứng của tế bào với các điều kiện nuơi cấy cụ thể. Xây dựng đường cong tăng trưởng cũng là 1 phương pháp thường được sử dụng để đánh giá tác động của các hormone, chất dinh dưỡng,... lên 1 dạng tế bào nhất định [26].
Mơi trường M0643 được chọn làm mơi trường tăng sinh tế bào MDCK trong điểu kiện phụ thuộc CO2 dựa theo kết quả hiệu suất nuơi cấy tế bào Vero của mơi trường này [4], [5]. Dựa vào đồ thị đường cong tăng trưởng, tốc độ phân chia r = 0,0296 tế bào/giờ, thời gian nhân đơi quần thể T = 33,78 giờ cũng như hình ảnh ghi nhận quá
3. Kết quả - Biện luận
Luận văn Thạc sĩ Sinh học – Trần Ngọc Thủy Tiên
38
trình phát triển của tế bào MDCK qua 7 ngày nuơi cấy trong mơi trường M0643 với 10% FBS, 5% CO2, 37oC, pH 7,2–7,4 (Hình 3.2d), ta cĩ thể kết luận mơi trường và các điều kiện nuơi cấy này cũng rất thích hợp cho sự tăng sinh của tế bào MDCK: tế bào sinh trưởng rất nhanh, mạnh; số lượng tế bào thu được sau 5 ngày nuơi cấy tăng lên xấp xỉ 10 lần so với lượng tế bào cấy vào ban đầu. Từ 36 giờ đến 96 giờ sau cấy chuyền là khoảng thời gian thích hợp để thực hiện lần cấy chuyền tiếp theo hay tiến hành các thử nghiệm khác vì giai đoạn này tế bào trẻ và cĩ sức sống tốt.
3. Kết quả - Biện luận
Luận văn Thạc sĩ Sinh học – Trần Ngọc Thủy Tiên
40 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.2. So sánh hiệu quả nuơi cấy tế bào MDCK trong các mơi trường khi thay đổi nồng độ FBS và CO2
3.2.1. Mục tiêu thí nghiệm
So sánh hiệu quả nuơi cấy tế bào MDCK trong các mơi trường M0643 và M1018 khi thay đổi nồng độ FBS và CO2 (với nhiệt độ nuơi cấy và pH mơi trường khơng đổi là 37oC và pH 7,2–7,4). Từ đĩ, cĩ thể lựa chọn thêm được các điều kiện nuơi cấy tốt khác cho tế bào MDCK.
3.2.2. Mơ tả thí nghiệm
Từ ngân hàng tế bào trữ trong Nitơ lỏng -196oC, tế bào MDCK được rã đơng và nuơi cấy trong mơi trường M0643, 10% FBS, 5% CO2, 37oC, pH 7,2–7,4 qua 2 đời (sử dụng flask T25cm2) để tế bào hồi phục sức sống sau thời gian bảo quản.
Tiếp theo, tế bào MDCK được cấy chuyền sang các mơi trường M0643 và M1018 với nồng độ FBS và CO2 khác nhau (Bảng 3.1). Việc cấy chuyền này được tiến hành qua 3 đời (sử dụng flask T25cm2) để tế bào thích ứng và sinh trưởng ổn định.
Bảng 3.1. Nồng độ FBS và CO2 dùng để so sánh hiệu quả nuơi cấy tế bào MDCK trong mơi trường M0643 và M1018.
Mơi trường Nồng độ FBS Nồng độ CO2 Nhiệt độ nuơi cấy pH mơi trường M0643 5% 5% 37oC 7,2–7,4 M1018 10% 0% 37oC 7,2–7,4 M1018 5% 0% 37oC 7,2–7,4
Sau đĩ, tiếp tục sử dụng các mơi trường như ở Bảng 3.1, tế bào MDCK được cấy chuyền sang các plate 12 giếng với mật độ là 2x105tế bào/giếng và thể tích mơi trường nuơi cấy là 2ml/giếng.
Hiệu quả nuơi cấy tế bào MDCK của các mơi trường thí nghiệm được đánh giá dựa trên số lượng tế bào thu được theo thời gian: mỗi ngày đếm số tế bào sống ở một giếng đối với từng loại mơi trường và giá trị được thể hiện là giá trị trung bình của 4 lần đếm.
3.2.3. Kết quả – Biện luận
Hình 3.3. Hiệu quả nuơi cấy tế bào MDCK của các mơi trường khi thay đổi nồng độ FBS và CO2. 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 T ổ ng s ố t ế bà o ( x1 0 5 )
ngày 0 ngày 1 ngày 2 ngày 3 ngày 4 ngày 5 ngày 6 ngày 7 Thời gian M1018 0% CO2 5% FBS M1018 0% CO2 10% FBS M0643 5% CO2 5% FBS
Các kết quả trên đồ thị thể hiện số tế bào thu được theo thời gian khi nuơi cấy tế bào MDCK trong các mơi trường M0643 và M1018 với nồng độ FBS và CO2 khác nhau (Hình 3.3) cho thấy:
• Mơi trường M1018 [0% CO2, 5% FBS] cho hiệu quả nuơi cấy thấp nhất. Số lượng tế bào tăng lên rất ít qua từng ngày nuơi cấy, đỉnh điểm của sự tăng trưởng với số tế bào thu được là 4,94x105 chỉ cao gấp 2,5 lần so với lượng tế bào cấy vào ban đầu.
• Mơi trường M0643 [5% CO2, 5% FBS] cho hiệu quả nuơi cấy trung bình với lượng tế bào thu được tăng lên khoảng 5 lần sau 5 ngày nuơi cấy.
• Mơi trường M1018 [0% CO2, 10% FBS] cho hiệu quả nuơi cấy cao nhất. Số tế bào thu được qua từng ngày nuơi cấy đều cao vượt trội so với 2 mơi trường cịn lại. Tại đỉnh điểm của sự tăng trưởng (ở ngày nuơi cấy thứ 5), tổng sinh khối tế bào đã tăng hơn 7 lần so với số tế bào cấy vào ban đầu.
3. Kết quả - Biện luận
Luận văn Thạc sĩ Sinh học – Trần Ngọc Thủy Tiên
42
Thêm vào đĩ, hình ảnh ghi nhận quá trình tăng trưởng của tế bào MDCK qua 7 ngày nuơi cấy trong các mơi trường thí nghiệm (Hình 3.2a, b, c) cũng cho thấy rõ hiệu quả nuơi cấy tốt nhất của mơi trường M1018 [0% CO2, 10% FBS] với các tế bào mọc dày, sát khít vào nhau và phủ kín bề mặt nuơi cấy, trong khi tế bào cĩ phần thưa hơn trong mơi trường M0643 [5% CO2, 5% FBS] và khơng phủ kín được bề mặt nuơi cấy trong mơi trường M1018 [0% CO2, 5% FBS].
Mơi trường M1018 được chọn thử nghiệm tăng sinh tế bào MDCK trong điều kiện khơng phụ thuộc CO2 dựa theo kết quả hiệu suất nuơi cấy tế bào Vero của mơi trường này [4], [5]. Với các kết quả ghi nhận được từ thí nghiệm 3.1 và 3.2, chúng tơi nhận thấy nồng độ 10% FBS cho hiệu quả nuơi cấy tế bào MDCK tốt hơn so với 5% FBS trong cả điều kiện cĩ và khơng cĩ CO2. Tuy nhiên, Yung-Chih cùng cộng sự (2008) đã sử dụng nồng độ 5% FBS (chi tiết về nồng độ CO2 khơng được cơng bố) [57] và Murakami cùng cộng sự (2008) đã sử dụng nồng độ 5% FBS, 5% CO2 [27] để tạo ngân hàng tế bào MDCK.
Từ kết quả trên, chúng tơi tiến hành dựng đường cong tăng trưởng của tế bào MDCK trong mơi trường M1018 [0% CO2, 10% FBS] dựa vào số tế bào thu được theo thời gian (Hình 3.4). Các pha tăng trưởng của tế bào được ngoại suy như sau:
• Từ 0 giờ đến 24 giờ: pha tiềm tàng.
• Từ 24 giờ đến 108 giờ: pha tăng trưởng.
• Sau 108 giờ: pha ổn định và suy tàn.
Các thơng số về đặc điểm tăng trưởng của tế bào MDCK trong mơi trường M1018 [0% CO2, 10% FBS] cũng được xác định tương tự như ở thí nghiệm 3.1:
• Tốc độ tăng trưởng: r = 0,0281 (tế bào/giờ).
• Thời gian nhân đơi quần thể: T = 35,55 (giờ).
Như vậy, so với mơi trường M0643 [5% CO2, 10% FBS], tế bào MDCK nuơi cấy trong mơi trường M1018 [0% CO2, 10% FBS] cĩ pha tăng trưởng ngắn hơn, tốc độ tăng trưởng nhỏ hơn và thời gian nhân đơi quần thể dài hơn (Bảng 3.2). Tuy nhiên, sự chênh lệch này khơng đáng kể nên nhìn chung mơi trường M1018 [0% CO2, (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
10% FBS] cũng cĩ thể là một lựa chọn tốt khác cho sự nuơi cấy tế bào MDCK. Ngồi ra, trong thực tế sản xuất, các flask hay chai xoay, bình khuấy nuơi cấy tế bào trong điều kiện khơng cĩ CO2 khơng cần phải được mở nhẹ nắp để hỗ trợ cho việc trao đổi khí, thuận tiện cho CO2 đi vào mơi trường nuơi cấy giống như khi nuơi cấy tế bào trong điều kiện cĩ CO2 nên cĩ thể hạn chế tối đa sự nhiễm khuẩn khơng mong muốn trong quá trình nuơi cấy.
Bảng 3.2. Các thơng số về đặc điểm tăng trưởng của tế bào MDCK khi nuơi cấy trong các mơi trường.
Mơi trường Pha tăng trưởng (giờ) Tốc độ tăng trưởng (tế bào/giờ) Thời gian nhân đơi quần thể (giờ) M1018 0% CO2, 10% FBS 84 0,0281 35,55 M0643 90 0,0296 33,78 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00
ngày 0 ngày 1 ngày 2 ngày 3 ngày 4 ngày 5 ngày 6 ngày 7
Thời gian T ổ ng s ố t ế b ào ( x10 5 ) NH = 1,39x106 NI = 0,27x106 t1 = 24 giờ t2 = 108 giờ
Hình 3.4.Đường cong tăng trưởng của tế bào MDCK trong mơi trường M1018. [0% CO2, 10% FBS]
3. Kết quả - Biện luận
Luận văn Thạc sĩ Sinh học – Trần Ngọc Thủy Tiên
44
3.3. Khảo sát ảnh hưởng của các nồng độ trypsin TPCK lên sự sống sĩt của tế bào MDCK
3.3.1. Mục tiêu thí nghiệm
Khảo sát sự nuơi cấy tế bào MDCK trong mơi trường nuơi virus được bổ sung trypsin TPCK với các nồng độ khác nhau, từ đĩ lựa chọn được nồng độ trypsin TPCK thích hợp cho mơi trường nuơi cấy virus cúm NIBRG-121xp-E1 vừa đảm bảo hiệu quả xâm nhiễm của virus vừa khơng gây chết tế bào.
3.3.2. Mơ tả thí nghiệm
Dịng tế bào MDCK đã thích ứng tốt trên mơi trường nuơi cấy tế bào M0643 [5% CO2, 10% FBS] được cấy chuyền sang các plate 12 giếng với mật độ là 2x105 tế bào/giếng và thể tích mơi trường nuơi cấy là 2ml/giếng.
Sau 4 ngày nuơi cấy, các plate tế bào được ủ với mơi trường nuơi cấy virus (mơi trường M0643, khơng huyết thanh, cĩ bổ sung BSA 0,2%) chứa các nồng độ trypsin TPCK được phân bố như Hình 3.5. Thể tích mơi trường là 2ml/giếng.
Các plate tế bào được giữ trong tủ ấm 37oC, 5% CO2 và được theo dõi trong 2 ngày.
1µg/ml
5µg/ml 5,5µg/ml 6µg/ml Chứng (-) (khơng trypsin)
Hình 3.5. Sơđồ phân bố các nồng độ trypsin TPCK trên plate 12 giếng.
2µg/ml 2,5µg/ml 1,5µg/ml
Thực hiện tương tự cho dịng tế bào MDCK đã thích ứng tốt trên mơi trường nuơi cấy tế bào M1018 [0% CO2, 10% FBS] với mơi trường nuơi cấy virus là mơi trường M1018, khơng huyết thanh, cĩ bổ sung BSA 0,2%; tủ ấm 37oC, 0% CO2.
3.3.3. Kết quả – Biện luận
Sau 24 giờ được ủ với mơi trường nuơi virus chứa các nồng độ trypsin TPCK khác nhau, cả với mơi trường M0643 và M1018, tế bào MDCK đều biểu hiện sức sống tốt ở nồng độ trypsin TPCK 1µg/ml. Ở các nồng độ trypsin TPCK 1,5µg/ml và 2µg/ml, tế bào MDCK bị biến đổi về mặt hình thái (tế bào bị kéo dài thành dạng sợi). Ở nồng độ trypsin TPCK 2,5µg/ml, tế bào MDCK bắt đầu cĩ hiện tượng bong trĩc khỏi bề mặt nuơi cấy; và từ nồng độ trypsin TPCK 3µg/ml đến 6µg/ml, tế bào MDCK bị trĩc hồn tồn khỏi bề mặt nuơi cấy (Hình 3.6 a2-a6, b2-b6).
Đến 48 giờ, tế bào MDCK vẫn duy trì được sức sống và sự tăng trưởng ở nồng độ trypsin TPCK 1µg/ml. Với nồng độ trypsin TPCK 1,5µg/ml và 2µg/ml, hình thái của lớp tế bào MDCK tiếp tục bị biến đổi và đã xuất hiện nhiều chỗ bong trĩc khỏi bề mặt nuơi cấy (Hình 3.6, a8-a10, b8-b10).
Glycoprotein chính của virus cúm, hemagglutinin, phải trải qua quá trình phân giải protein – từ protein tiền chất HAo thành 2 tiểu phần HA1, HA2 – để cĩ chức năng hồn tồn [46], [47], [50]. Chỉ cĩ hemagglutinin đã được phân cắt mới cho phép virus cúm xâm nhiễm, đồng hĩa vào tế bào và nhân lên [47], [50]. Các chủng virus cúm độc lực thấp được hoạt hĩa bởi trypsin hoặc các enzyme tương tự trypsin do vị trí phân cắt hemagglutinin của chúng cĩ dạng trypsin (trypsin-like cleavage site) – chỉ chứa 1 amino acid cĩ tính base; cịn vị trí phân cắt hemagglutinin của các chủng virus cúm độc lực cao lại cĩ dạng furin (furin-like cleavage site) – chứa nhiều amino acid cĩ tính base – nên chúng được hoạt hĩa bởi các protease khác (chẳng hạn như furin) [29], [37]. Vì vậy, điều kiện tiên quyết nhằm bảo đảm quá trình xâm nhiễm của virus cúm cĩ thể diễn ra là các protease tương ứng cần phải được bổ sung vào mơi trường nuơi cấy để phân cắt hemagglutinin [46], [47].
3. Kết quả - Biện luận
Luận văn Thạc sĩ Sinh học – Trần Ngọc Thủy Tiên
46
Do đĩ, trong các thí nghiệm với virus cúm NIBRG-121xp-E1 của nghiên cứu này, chúng tơi sử dụng trypsin TPCK trong mơi trường nuơi cấy virus và chỉ bổ sung trypsin 1 lần vào thời điểm xâm nhiễm (bắt đầu nuơi cấy) [17]. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Sau khi ủ tế bào với 1 liều xâm nhiễm thích hợp của virus cúm, thơng thường, tế bào vẫn tiếp tục tăng trưởng trong 1 khoảng thời gian nhất định cho đến khi tồn bộ lượng tế bào bị virus xâm nhiễm và phá hủy hồn tồn [4], [5]. Do đĩ, mơi trường nuơi cấy virus cúm vừa phải đảm bảo được hiệu quả xâm nhiễm của virus (cĩ bổ sung trypsin TPCK giúp phân cắt hemagglutinin) vừa phải thuận lợi cho sự phát triển của tế bào (BSA được sử dụng thay cho huyết thanh để cung cấp những chất dinh dưỡng cần thiết, đồng thời hạn chế sự hiện diện của các chất ức chế hoạt tính trypsin cĩ trong huyết thanh). Tuy nhiên, nồng độ tryspin sử dụng phải cân đối với mật độ tế bào vì hàm lượng trypsin quá cao trong mơi trường cĩ thể gây bong trĩc tế bào [17]. Điều này giúp giải thích cho các kết quả thu được trong thí nghiệm này: ở mật độ tế bào MDCK khoảng 1,3x106 và 1,8x106 (sau 4 ngày nuơi cấy trong mơi trường M0643 và M1018 với mật độ tế bào ban đầu là 2x105, dựa vào đường cong