2.2.3.1. Định nghĩa – Nguyên tắc
Tế bào được nuơi cấy trong bình khấy với giá thể vi hạt Cytodex1. Khi tế bào đã phủ kín bề mặt vi hạt, virus sẽ được cho xâm nhiễm vào tế bào.
2.2.3.2. Các bước thực hiện
a. Nuơi cấy tế bào MDCK trên vi hạt Cytodex1
Vi hạt Cytodex1 sau khi được làm trương nở và hấp vơ trùng theo hướng dẫn của nhà sản xuất [62] sẽ được dùng làm giá thể nuơi cấy tế bào MDCK.
• Cấy tế bào MDCK với mật độ mong muốn vào huyền phù vi hạt trong bình khuấy.
• Bổ sung thêm mơi trường nuơi cấy tế bào cho đến 1/2 thể tích cần dùng, lắc đều rồi để yên bình khuấy trong tủ ấm 37oC.
• Sau mỗi 1 giờ, lắc đều bình khuấy trong 1 phút rồi trích ra 0,3ml mẫu để kiểm tra sự bám của tế bào lên vi hạt bằng kính hiển vi.
• Khi phần lớn số vi hạt đã cĩ tế bào bám xung quanh, bổ sung đủ thể tích mơi trường nuơi cấy tế bào cần dùng vào bình khuấy rồi đặt bình khuấy vào tủ ấm được cài đặt nhiệt độ là 33oC (vì trong quá trình khuấy liên tục, máy khuấy từ sẽ tự phát sinh nhiệt làm tăng nhiệt độ của tủ ấm) và tốc độ khuấy là 50vịng/phút.
• Sau mỗi 24 giờ, lắc đều bình khuấy và trích ra 0,3ml mẫu để kiểm tra sự phát triển của tế bào trên vi hạt bằng kính hiển vi.
b. Nuơi cấy virus NIBRG-121xp-E1 trên vi hạt Cytodex1
Khi lớp đơn tế bào MDCK đã phủ kín bề mặt Cytodex1 thì tiến hành xâm nhiễm virus.
• Ủ tế bào với 10ml mơi trường nuơi cấy virus chứa thể tích virus đạt liều xâm nhiễm mong muốn.
• Giữ yên bình khuấy trong tủ ấm 37oC, lắc đều sau mỗi 15 phút.
• Sau 60 phút, bổ sung phần mơi trường nuơi cấy virus cịn lại cho đến thể tích cần dùng rồi đặt bình khuấy vào tủ ấm được cài đặt nhiệt độ là 33oC, tốc độ khuấy là 50vịng/phút.
• Thu nhận dịch mẫu nuơi cấy virus để theo dõi hiệu ứng hủy hoại tế bào (CPE) và xác định hiệu giá virus (HA và TCID50/ml).
c. Đếm tế bào
Phương pháp đơn giản và thường được sử dụng để xác định số lượng tế bào khi nuơi cấy trên các vi hạt là phương pháp đếm nhân tế bào [62]. Xử lý 1ml huyền phù vi hạt cĩ tế bào bám xung quanh bằng dung dịch acid citric–tím tinh thể theo hướng
2. Vật liệu – Phương pháp
Luận văn Thạc sĩ Sinh học – Trần Ngọc Thủy Tiên
29
cơng thức ở mục 2.2.2.2. (hệ số pha lỗng a = 1).
[3], [12]
uơi cấy tế bào. Khi tế bào đạt đến pha tăng dẫn của nhà sản xuất [62] (Hình 2.4) rồi thực hiện đếm và tính số nhân tế bào theo
Hình 2.4. Nhân tế bào được nhuộm với dung dịch acid citric–tím tinh thể.
Vi hạt Cytodex1
Nhân tế bào