c định kiểu nhân để đếm số lượng nhiễm sắc thể.
đêm trong dung dịch rửa lam.
c cất rồi ngâm lam trong uyền phù tế bào lên lam, dùng kẹp gắp lam ra
2.2.4.1. Định nghĩa – Nguyên tắc
Tế bào đang ở pha tăng trưởng đượ
2.2.4.2. Các bước thực hiện
a. Chuẩn bị lam kính [28]
• Ngâm lam kính qua
• Rửa lam dưới nước vịi; rửa lại lần nữa bằng nướ dung dịch bảo quản lam kính.
• Khoảng 3 phút trước khi nhỏ h
khỏi dung dịch bảo quản và cắm sâu lam vào đá (hạn chế tối đa việc để lại dấu vân tay trên lam).
b. Chuẩn bị huyền phù tế bào
• Sử dụng các flask T25cm2 để n
• Sau 3 – 5 giờ, thực hiện trypsin hĩa bằng trypsin/EDTA để trĩc tế bào khỏi bề mặt nuơi cấy.
• Chuyển huyền phù tế bào vào tube ly tâm 15ml, ly tâm 10 phút ở tốc độ 3000vịng/phút và đổ bỏ phần dịch nổi.
• Huyền phù nhẹ nhàng phần cặn tế bào trong 5ml dung dịch nhược trương và giữ yên trong 20 phút ở 37oC.
• Nhẹ nhàng bổ sung 5ml dung dịch cố định, trộn đều và ly tâm 3000vịng/phút trong 5 phút.
• Đổ bỏ phần dịch nổi. Trộn cặn tế bào trên máy vortex: tay giữ đáy tube ly tâm đưa tube vào máy vortex và chầm chậm thêm 5ml dung dịch cố định mà vẫn vortex liên tục.
• Để yên tế bào 10 phút trong đá.
• Ly tâm 3000vịng/phút trong 5 phút và đổ bỏ dịch nổi.
• Trộn cặn tế bào bằng máy vortex như trên trong 1ml dung dịch cố định để thu được huyền phù tế bào dùng định kiểu nhân.
c. Nhuộm nhiễm sắc thể [3], [12], [58]
• Hút huyền phù tế bào vào đầu pippette Pasteur và nhỏ 1 – 2 giọt từ độ cao khoảng 30cm lên lam kính đã được chuẩn bị và giữ lạnh (nghiêng lam 1 gĩc khoảng 60o so với mặt phẳng ngang); tiếp tục nghiêng lam để giọt huyền phù tế bào chạy xuống khi nĩ lan ra.
• Làm khơ nhanh lam kính bằng cách đặt lam trên becher nước sơi.
• Ngâm tồn bộ lam kính 15 phút trong thuốc nhuộm Giemsa đã pha lỗng.
• Rửa từng lam kính dưới nước vịi để loại bỏ hết thuốc nhuộm kết tủa.
• Làm khơ lam bằng giấy thấm.
d. Đếm số lượng nhiễm sắc thể
• Bộ nhiễm sắc thể được quan sát bằng kính hiển vi Eclipse E200 ở vật kính X10 và X40, và được đếm số lượng nhiễm sắc thể ở vật kính X100.
2. Vật liệu – Phương pháp
Luận văn Thạc sĩ Sinh học – Trần Ngọc Thủy Tiên
31
• Bộ nhiễm sắc thể được chụp hình bằng máy DS-Ri1 đi kèm kính hiển vi Eclipse 80i ở độ phĩng đại X1000 và chất lượng hình ảnh 4076x3116 (16bt).